转基因技术应用

转基因技术应用1/5《动物遗传育种与繁殖专论》课程作业转基因技术在畜牧生产中的应用姓名：学号：转基因技术应用2/5转基因技术应用3/5转基因动物技术在畜牧生产上的应用将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体表达外源基因的动物，称为转基因动物。转基因动物表达系统，包括外源基因、表达载体和受体细胞等，基因组的转移则是细胞核移植和动物克隆技术，人工合成与设计基因、全基因乃至基因组的转基因技术是合成生物学。转基因动物技术应用于畜牧生产,在改良动物生产性状、提高畜禽抗病力以及生产人药用蛋白等非常规畜牧产品方面,已显示出广阔的应用前景。1转基因动物技术概述使动物组织能够特异表达外源蛋白质,需要人为地将编码这种蛋白质的基因转移到动物的胚胎中,使目的基因能够整合到动物染色体上,进而得到表达。目前,在转基因上主要有4类:A参与编码和调节机体组织生长发育的基因。例如:促生长基因方面的研究有导入生长激素(GH)基因,胰岛素样生长因子(IGF-1)和人生长激素释放因子;B与动物生产力密切相关的经济性状的主效基因。例如:应用在羊毛生产上的促进羊毛生产的基因;C抗性基因,目的在于培育出抗某些疾病或具有广谱抗病性的品系;D治疗人类疾病所需要的蛋白质基因。较为常用的对转基因阳性事件的鉴定方法有斑点杂交、PCR检测和Southern杂交。其中斑点杂交方法较为简单,但容易出现假阳性。PCR技术因其简单易行而得到广泛使用,但当动物体内整合的外源基因与内源基因有较高的同源性时,PCR检测会产生假阳性。Southern杂交是目前最具权威性的鉴定方法,但其操作繁琐,工作量大。为了改进这些缺陷,国内外学者进行了进一步探索。胡以平等对PCR产物进行Southern杂交分析,既方便快捷,又具有Southern杂交的权威性。2转基因动物技术的发展建立转基因动物的方法主要有:显微注射法、逆转录病毒载体法、精子载体法、胚胎干细胞介导法、体细胞核移植技术。2.1显微注射法1980年,Gordon等将显微注射技术用于小鼠受精卵的基因导入,建立了前核显微注射的转基因方法。1982年Palmilter等将带有小鼠金属硫蛋白基因启动子的生长激素基因导入小鼠的受精卵,获得“巨型小鼠”,在生命科学领域引起巨大轰动。按该方法,转基因鱼、转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊相继成功。目前,该方法相对简单、整合率高,而且比较稳定,因而得到了广泛应用;但缺点是不能控制转基因的整合位点及整合的拷贝数,不利于研究基因的结构、功能及表达调控。转基因技术应用4/52.2逆转录病毒载体法1974年Jaenisch等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中,发现获得小鼠体内有SV40DNA整合。继之Jaenisch等人又成功地用逆转录病毒法制作转基因小鼠。随后,转基因鸡、转基因牛相继产生。An2thony等发现逆转录病毒载体感染处于减数分裂中期(MII)的卵母细胞,更有利于转基因牛的产生。逆转录病毒载体法导入外源基因时,外源基因多属单拷贝整合,该特性已被广泛应用于基因定位整合方面的研究中。2.3精子载体法1989年,Lavitrano等将PSV2CAT质粒与小鼠的附睾精子,在等渗溶液中共育30min后进行体外受精和移植,产生转基因阳性小鼠并能遗传给后代,后代尾组织和肌肉组织中CAT基因表达十分可观。Rottman等对上述精子载体法进行了改进,其将外源DNA用脂质体包埋,再与鸡精子共同孵育,然后人工受精取得成功。Anthony等尝试了一种新的方法,预先将小鼠的精子进行破膜处理,再与外源基因共孵育1min,然后将精子头部显微注射入MⅡ期的小鼠卵母细胞,获得成功。该项研究揭示,精子膜破损后外源DNA穿过外膜吸附于内膜,更有利于转基因动物的产生。2.4胚胎干细胞介导法胚胎干细胞(ES)是早期胚胎经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系,在滋养层或条件培养基中具有无限增值能力。从胚泡期胚胎内的细胞群中分离细胞,培养并用外源基因进行转染,外源基因通过随机插入或同源重组的方式整合到ES细胞的基因组中。将转入外源基因的ES细胞重新导入囊胚或进行克隆,可培育转基因个体。ES细胞被公认为是最理想的受体细胞,是转基因动物、细胞核移植、基因治疗等研究领域的一种新的试验材料,具有广泛应用前景。但ES细胞不易建株,在小鼠上应用比较成功,而在其他大动物上的应用尚处于探索阶段。2.5体细胞核移植法1997年,世界上首例体细胞核移植克隆绵羊—Dolly的诞生,是转基因动物研究史上的又一重大突破;继之,Wilmut研究小组用胚胎细胞作核供体,获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX的转基因克隆绵羊“Polly”。Alexander等用非基因母羊与1只转基因公羊精子人工受精后怀孕40d的胎儿成纤维细胞作核供体,获得了3只转人抗胰蛋白酶基因的奶山羊。目前,利用体细胞核移植法已获得了转基因羊、鼠、牛、猪,对体细胞进行基因改造,用于核移植可以提高转基因效率,对于与性别有关的性状(生产蛋白必须是雌性个体),可以预先选择雄性或雌性克隆,从而预定胚胎和后代的性别。该技术的另一个优点是可以实现大片段基因的转移;更重要的是,在胚胎移植前,它就筛选阳性细胞作为核供体,这样核移植产生的胚胎为阳性,最终产生的后代也是100%的阳性。3转基因动物技术在畜牧生产中的应用转基因技术应用5/53.1利用转基因技术改良畜禽生产性状受Palmiter转基因“巨型小鼠”的启发,将人的生长激素基因导入猪的受精卵获得成功。转基因猪与同窝非转基因猪比较,生长速度和饲料利用率显著提高,胴体脂肪率明显降低。1987年,Pinkert和Pursel等分别用带有金属硫蛋白基因启动子的牛生长激素融合基因通过显微注射法,获得8头可表达牛生长激素的转基因猪,其体格大,日增重增加,饲料转化率提高。Damak等将小鼠超高硫角蛋白启动子与绵羊的IGF—1cDNA融合基因显微注入绵羊原核期胚胎,移植后生出5只羔羊,其中2只(1公1母)为转基因阳性。该公羊与43只母羊交配,生出85只羔羊,其中43只(50.6%)为转基因阳性。羔羊在14月龄剪毛时,转基因羊净毛平均产量比其半同胞非转基因羊提高了62%,公羔羊产毛量提高的幅度(92%)高于母羔羊(34%)。在毛纤维直径、髓质以及周岁体重方面无显著差别。此外,Powell等将毛角蛋白II型中间细丝基因导入绵羊基因组,转基因羊毛光泽亮丽,羊毛脂的含量明显提高。3.2利用转基因动物技术培育抗病品系对一些种属特异性疾病,可以从抗该病的动物中克隆出目的基因,导入易感动物品种的基因组。若该目的基因能够在宿主基因中表达,那么转基因动物对该病毒具有一定的抵抗力,由此可培育出抗该病品系。早在20世纪60年代,人们就发现具有MX等位基因的小鼠对A型及B型流感有天然的抵抗力。Carber等将克隆的小鼠MX基因的有义链和反义链插入禽反转录病毒载体中,并以之转染鸡胚胎成纤维细胞(CEF);结果表明,插入有义链反转录病毒载体转染的CEF对人流感病毒、禽流感病毒的感染具有抵抗作用。继之,有人将小鼠抗流感病毒基因导入猪体内,使转基因猪增强了对流感病毒的抵抗能力。中国农科院兰州兽医所曾将抗猪瘟病毒(HVC)的基因导入猪的受精卵,获得抗猪瘟病毒的猪。3.3利用转基因动物技术生产非常规畜牧产品利用转基因动物生产目的基因产物,是转基因动物应用的又一个重要领域。将外源基因转入动物,获得转基因动物,从动物的乳汁或血液中获得目的产物,代替传统上使用的发酵罐。目前,利用转基因动物作为生物反应器生产人类药用蛋白等非常规畜牧产品,是世界范围内转基因研究的热点之一。1991年,英国科学家将人的a1-抗胰蛋白酶基因转入绵羊受精卵,成功获得了5只转基因绵羊,其4只母绵羊乳中都表达了α1-抗胰蛋白酶;而且从绵羊乳中纯化的α1-抗胰蛋白酶与人血浆中的α1-抗胰蛋白酶具有相同的生物学活性。荷兰Lubon等将人的凝血因子Ⅷ基因导入猪,并在猪乳中表达。利用这种转基因猪乳生产人的凝血因子Ⅷ研究已经获得成功。我国科学家也成功培育出乳中含有活性凝血因子Ⅸ的转基因绵羊。应用转基因动物乳腺生产多种具有生物活性的人类蛋白质,这些转基因动物技术已经在家兔、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪等转基因动物中获得成功。获取的重组蛋白质包括:t-PA、αl-AT、蛋白C、hSA、bGH、hAFP、LAtPA等。我国科学家也已经成功构建了能在转基因鸡蛋清中表达“人瘦素蛋白”。该技术若经稳定后,可以利用鸡蛋清作为生物反应器,在蛋清中生产有药用价值的蛋白多肽,如人血清白蛋白等各种细胞因子、疫苗、抗体等。