农杆菌介导的植物转基因技术

农杆菌介导的植物转基因技术讲课人：杨晶分子生物学操作技术之实验五一、转基因植物概述转基因辣椒转基因玉米转基因玫瑰日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；2、掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。二、实验目的根癌农杆菌，属根瘤菌科，为革兰氏阴性。根癌农杆菌感染双子叶植物时，可在被感染的伤口形成冠瘿瘤,诱导有关的质粒为Ti质粒。Ti质粒上有一段T-DNA区，人们将外源基因插入到T-DNA区，借助农杆菌的感染使携带外源基因的T-DNA区转入植物基因组中，从而实现外源基因向植物细胞的转移和整合。三、实验原理农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤农杆菌感染柳树产生冠瘿瘤1、仪器：超净工作台，离心机，恒温摇床，组织培养室；2、试剂：农杆菌EHA105，YEB培养基，MS液体培养基，共培养基（MS+6-BA+NAA），分化培养基（MS+6-BA）生根培养基（MS+IBA+NAA）；3、材料：红花无菌苗。四、实验仪器与试剂phaT35SRBNOS(A)BarTargetgeneNcoIkpnIHindIIIspeILBphaPPstIXmnI改造后的农杆菌的T-DNA区，含有目的地基因和Bar筛选基因五、实验方法（一）农杆菌菌液的制备用牙签蘸取农杆菌，在YEB培养基上划线，达到纯化农杆菌的目的。（二）制备工程菌（摇菌）用牙签挑取划线得到的单菌落，将其置于YEB液体培养基中，进行液体振荡培养，28℃,180rpm，制备用于侵染转化的工程菌。将农杆菌离心，2000rpm，10min，收集菌体,目的是去除细菌培养基的高浓度盐。（三）离心，收集菌体（四）重悬菌体用液体MS培养基将菌体用移液枪吹打起来，使菌体重新悬浮，其目的是减少细菌培养基对植物体的伤害。将预培养的红花子叶放入菌液中浸染8-25min，在侵染过程中轻轻摇晃，确保菌液充分进入到红花子叶中。（五）侵染转化取出外植体，将其放在无菌滤纸上，充分吸干菌液，避免菌液残留在红花子叶上，使其在培养过程中，菌液过量生长。（六）除菌首先将红花子叶置于共培养上，使其生长。培养一周后，将其转入分化培养基上，进行培养，待其诱导分化出不定芽后，继续培养，不定芽分化成苗后，将其移入生根培养基中，培养获得转基因植株。（七）侵染后的培养六、实验结果农杆菌侵染时间8min10min12min15min20min25min外植体数量101010101010染菌情况分化情况转化率七、注意事项1、在操作过程中，一定要保证无菌，整个操作过程均需要再无菌的条件下完成。2、进入超净工作台前，要检查紫外灯是否关闭，避免对皮肤造成损害。3、进入超净工做台进行实验时，要进行表面消毒，用酒精喷洒并擦净台面和双手。八、思考题1、农杆菌转化的基本步骤有哪些？2、农杆菌遗传转化的优缺点？3、哪些措施可以提高农杆菌介导的转化率？