生物芯片分类及应用

1一、概念、分类及应用2（一）、两个概念生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片技术是通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列通过高速机器人以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。3微阵列芯片（Microarray）微型实验室芯片(Lab-on-a-chip)液体芯片(Liquichip)（二）、生物芯片分类及应用4Lab-on-a-chip微型实验室芯片是通过在芯片上刻成微流路径从而将涉及生物检测的主要步骤—样品准备/生化反应/结果检测—整合在一张芯片上。567LiquichipBead,Capturemolecule,Analyte,Reportermolecule是构成liquichip的4个主要部分。Bead上带有两种荧光，根据这两种荧光的比例可以将bead分为多种。目前已有48种，正在开发中。Capturemolecule:作用相当于探针，能特异性的与被检测物结合。Analyte:样品中被检测的成分。Reportermolecule:带有荧光的报告分子，能特异性的与被检测物结合。8Liquichip反应的一般步骤：1.先将capturemolecule结合在bead上，2.将这种标记了的bead与样品反应。Capturemolecule可以与相应的analyte特异性的结合，3.此时再加入荧光标记的，特异结合analyte的reportermolecule。4.检测：用liquichipworkstation进行检测。原理是同时对bead和reportermolecule上的荧光进行检测。从而确定被结合的analyte的种类和数量。9Liquichip技术特点描述1．基于bead的这种固相反应技术，具有灵敏度高、信号强度高、灵活性好、所需样品量少的特点。2．与传统的蛋白芯片相比，有两大优势，反应速度更快，灵活性更好。3．由于检测方法的特点，在大部分的实验过程中，都不需要洗脱步骤，省时，且不会破坏反应的动态平衡。4．有配套的蛋白表达和纯化体系。（his-tag）10Lquichip应用领域：蛋白质定量蛋白质功能研究蛋白表达谱分析。蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受体-配基分析、蛋白质核酸相互作用分析分析。11微阵列芯片蛋白芯片基因芯片12蛋白芯片(ProteinChips)高通量微阵列蛋白分析方法利用抗体抗原结合原理，采用化学发光或荧光检测标记抗体或抗原，来检测抗原或抗体。13蛋白芯片应用免疫学分析蛋白与蛋白之间相互作用DNA与蛋白质分子相互作用14基因芯片基因芯片是通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列通过高速机器人以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。微阵列技术巨大优势在于它可以并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片则提供了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性研究和基因分型。从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。15基因芯片发展历史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray16基因芯片按内涵划分：cDNA芯片Oligo芯片:25mer(affymetrix),70mer(Operon)，80mer（Clontech）,按功能划分：基因组芯片：检测某一基因是否存在，若存在，拷贝数是多少。探针是DNA.表达谱芯片：确定基因表达的途径与表达产物。探针是RNA或cDNA测序芯片：通过探针与微阵列的配对分析获得探针的序列结果。17基因芯片应用基因表达检测多态性分析遗传图谱定位基因分型通过杂交反应测定序列18基因芯片应用领域遗传疾病研究癌症家系遗传疾病普通基因突变疾病感染性疾病药物筛选动物植物遗传筛选育种个人基因身份证环境监测19（三）、生物芯片应用优势高通量平行分析样品自动化程度高省时省力所需样品试剂少保护环境成本低20生物芯片应用优势生物信息数据累积为生物信息公共数据库添加更多数据有利于研究基因序列与生物表型之间的关系有助于理解疾病发生的机制21二、生物芯片制作技术介绍22生物芯片制作方法分类探针固定方式片基显色及检测方式原位合成(insitusynthesis)钢性片基如玻片、半导体硅片等荧光，激光共聚焦扫描、定量分析；生物传感器等预先合成后点样(off-chipsynthesis)玻片、薄膜片基如NC、Nylon膜等荧光，激光共聚焦扫描、定量分析；生物传感器等23原位合成(InSituSynthesis)化学合成原子印章原位光刻合成24原位光刻合成美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。25原位光刻合成原理Lightdirectedoligonucleotidesynthesis.Asolidsupportisderivatizedwithacovalentlinkermoleculeterminatedwithaphotolabileprotectinggroup.Lightisdirectedthroughamasktodeprotectandactivateselectedsites,andprotectednucleotidescoupletotheactivatedsites.Theprocessisrepeated,activatingdifferentsetsofsitesandcouplingdifferentbasesallowingarbitraryDNAprobestobeconstructedateachsite.26预先合成后点样(off-chipsynthesis)接触式点样非接触式点样27基因芯片点样的方式接触式点样---适合于DNA芯片的制作即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上28接触式点样Best!29ArrayItChipMakerPins带有细槽的不锈钢针尖载样能力:200to600nL点样体积:250pLto2.5nL(pinsize)点样直径:100µmto500µm(pinsize)1.Dippingofpinforsamplepickup2.Touchingofslidewithpintoleavespot3.Controlprintvolumewithpinsize30StealthandChipmakerPin(TeleChem)31Chipmaker点样技术32StealthPins33CatalogNumberSpotDiameter(μm)Uptakevolume(μl)DeliveryVolume(nl)Minimumspotspacing(μm)Maximumsubgridperpin(spots)Density(spots/cm2)MaximumnumberOfspots(18mm×72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,40034TeleChem公司点样针技术不断发展的专利针技术共有30种针供选择与斯坦福大学共同发展专利pin,带样稳定，样品利用率高单次带样可连续点样达200--1500次特殊不锈钢材料，适用于各种溶液实际点样直径75--250um,可根据不同样品选择相应pin相当容易更换pin和pinhead以适应不同需要35基因芯片点样的方式非接触式点样---适合于蛋白芯片的制作它是以电磁阀或压电原理将样品直接喷至固相支持物表面36非接触式喷点技术ThermalSolenoid螺线管PiezoelectricDP37Synquad：通过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来精确控制滴液Piezoelectric：用压电晶体将液体从孔中喷出的压电技术，两个压电晶体同时加脉冲通电触发这两个压电晶体往喷管中间变形挤压喷管侧壁，喷管出现收缩压迫液体从喷嘴喷出。DP38非接触式点样：synQUADTechnology39StepperMotorDrivenSyringeSolenoidInkjetValveOrificeAspirateandPrintforMakingArrays40CharacteristicsofsynQUADTechnologyWidedispenserangeLownanolitertohighmicroliterExcellentlinearityPreciseandaccurateCV’stypicallylessthan10%Precisionlessthan5%Non-contactdispensemechanismEasiermechanicalalignment(384,1536,…)“On-the-fly”printingpossibleCapableofdispensingontomembranesorslidesMultipleliquidhandlingmodesAspirate/DispenseContinuousReagentDispensing41synQUADvsPiezoelectricPrintingsynQUAD/nQUADPatentedbyCartesianUsescommerciallyavailablecomponentsRobustandreliabledeliverymechanismLownanolitertolowmicroliterdispensevolumemaximumdensity:200to400spots/cm2Piezoelectric•Abbottholdskeypatentsontechnology•Dispensesusceptibletoairbubbles•Mid-picoliterdispensevolume•~2500spots/cm242三、生物芯片检测系统CCD扫描仪非共聚焦激光扫描仪激光共聚焦扫描仪43数值孔径与采光效率CollectionEfficiencyvsNA0%10%20%30%40%50%0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0NumericalApertureCollectionEfficiencyNA0.3NA0.8.NA=sin(),whereisthe½angleofthecone44激光共聚焦（聚焦）Thefluorescencesourceisattheobjectivelens’focusLightgoesthroughthepinholetothedetector45激光共聚焦（非聚焦）Fluorescencesourcebelowfocus(e.g.outoffocus)Outoffocuslightismostlyblockedatthepinhole46ConfocalArtifactRejectionNoPinholeWithPinholeDustartifactsreducedbyatleastafactorof1047