生物芯片技术

ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics生物芯片技术温州医学院检验医学院生命科学学院分子生物学检验技术∙第九章免疫共沉淀（Co-IP）Pulldownassay章节提要•生物芯片始于上世纪90年代，随着人类基因组计划而诞生的一项新技术。它是由Southern印迹技术衍生而来，是一门多学个交叉的综合技术，这项技术涉及到了生命科学、计算机、微机械、微电子、物理、化学、数学等领域。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics•定义：通过微加工和微电子技术，在固相基质表面集成了成千上万密集排列的分子微阵列，以实现对组织，细胞，核酸，蛋白质及其他生物分子进行有效、准确、高通量的检测。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics章节提要•种类：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、液相芯片、缩微芯片实验室。•各类芯片的定义。•最终目标：把生物和化学等领域所涉及的样品制备，生化反应和检测分析的整个过程集成化，并缩微到一张芯片上自动完成，形成缩微芯片实验室。章节提要章节提要•芯片技术的优点：多样品并行处理、分析速度快、所需样品量少、污染少。•应有的领域：基础研究、临床诊断、药物筛选，指导用药与治疗、农作物优育优选、环境检测、卫生监督、司法鉴定。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics•以结构与工作机制可分为微阵列芯片与微流体芯片•微阵列芯片：由生物材料微阵列构成的芯片，以分子间的亲和结合作为核心，以在固相载体表面固定一系列可寻址的识别分子阵列为结构特征，如碱基配对，抗原抗体结合，包括基因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics章节提要•微流体芯片：以微管道网络为结构特征，实现对各种生化组分的微流控操作和分析，包括毛细管电泳芯片，PCR反应芯片等•缩微芯片实验室优势：将样品制备、生化反应、检测等过程集成在一个系统中。它是未来芯片发展的主流方向之一，也是生物芯片发展的最终目标。章节提要ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics本章节主要的学习内容•基因芯片（genechip）•蛋白质芯片（proteinchip）•缩微芯片实验室（laboratoryonachip）ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第一节基因芯片•基因芯片(genechip)又称DNA芯片（DNAchip）或DNA微阵列（DNAmicroarray）。•将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。DNAMicroarray的原理•经过标记的待测样品DNA通过与芯片上特定位置的探针按碱基配对原理杂交后，经激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过检测杂交信号强度来获取样品分子的数量与序列信息，用计算机软件进行数据比较与分析，从而对基因序列及功能进行大规模，高通量的研究。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics一、基因芯片的原理•基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速核酸序列分析手段。同时也是最先发展，最为成熟，最先商品化的生物芯片芯片分类•载体不同：玻璃芯片、膜芯片、硅芯片、陶瓷芯片•方法不同：原位合成、直接点样•探针不同：寡核苷酸、cDNA、基因组芯片•用途不同：表达谱、测序芯片、诊断芯片、SNP分型分析步骤为：生物芯片的制作、样品处理及标记、杂交或反应、杂交检测及数据处理等。芯片设计芯片制作PCR扩增靶基因标记原位合成点样方法实际应用样品处理芯片杂交数据分析杂交检测放射显影光化学电化学酶促反应芯片技术发展的关键•无孔的固相载体，如玻璃•高密度寡核苷酸片段的原位合成技术ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics载体的定义与种类•定义：用于连接、吸附或包埋各类生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料。玻片固体片状硅片瓷片硝酸纤维素膜膜性材料尼龙膜聚丙烯膜•具有可以进行化学反应的活性基团，便于与生物分子进行偶联。•要有惰性与稳定性：惰性（非特异吸附和其他性能不干扰生物分子的动能）稳定性（能承受一定的压力与酸碱条件的变化）•良好的兼容性(便于制作其他类型的芯片)载体材料的要求载体的表面处理•原因：核苷酸片段无法直接连接到载体表面，故需要活化，便于固定生物分子。•试剂：碳二亚氨，N-羟基琥珀酰亚胺酯。•活性基团：氨基、羟基、巯基、醛基•处理依据：载体表面性质、生物分子的化学特征常见载体•薄膜状载体优点：与核酸亲和力强、技术成熟。•膜结合玻璃片优点：亲和性、刚性ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics处理载体的基本要求•修饰后表面要均匀且硬质•有效固定各种类型生物材料•在激发光下，荧光背景低•高密度，大量，均匀的点阵，变异系数小ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探针固定到固相支持物上，方法有两种：光去保护并行合成法原位合成分子印章原位合成法喷印合成法（压电打印法）合成点样通过特定的高速点样机器人直接将探针点在芯片上的技术。合成cDNA探针的原则•设计于目的cDNA的3’端。•避免长片段重复序列•长度为0.1-2.5kbZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics寡核苷酸探针•长度16-26bp，G+C在40-60%•探针内不用大于4bp的碱基互补配对序列，同一个碱基连续出现小于4个•与非靶序列的同源性低于70%，小于8个碱基相同。•设置多个序列相近的参考寡核苷酸探针。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics点突变检测核苷酸探针•设计方法：等长移位设计法按靶序列从头到尾依次去一定长度的互补的核苷酸序列组成的一套探针组合。这套探针是野生型探针，然后对每一野生型探针中间的某一碱基用其他三种碱基替代。•主要目的：进行点突变扫描ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探针在载体表面的固定（一）•合成点样法：通过PCR扩增或人工合成序列，通过计算机控制的三坐标工作平台，用针头和微喷头分别把探针溶液分配在固相载体表的位点上，通过物理或化学法固定探针。•优点：技术成熟，灵活性大，适用于单位自行合成。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics•在硬质表面上直接合成寡核苷酸探针序列•原位光刻合成法、压电打印合成法，分子原位合成法。•技术瓶颈：高空间分辨率的模板点位技术、高合成效率的DNA化学合成技术•优点：标准化，规模化ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探针在载体表面的固定（二）ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics原位合成的原理•基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理。•它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序，如要合成AGCT四种碱基所有序列组合的四聚体(44种)。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics原位光刻合成法•主要步骤为：1.首先用光敏保护支持物活化基团2.选择合适的蔽光膜保护不需要聚合的地方，暴露需要聚合的位点3.在激光点光源的照射下，去除光敏感保护基团，使该位点显露出活性的羟基或者氨基4.加入的单核苷酸，与活化端发生化学反应5.然后更换蔽光膜，重复上步骤，完成核苷酸的固定连接（见图）。优点：在较小的区域制造大量不同的探针。图9-2基因芯片原位合成原理示意图ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics喷印合成法（压电打印法）•原理：墨盒内所用的ATCG四种碱基而非碳粉。•步骤：将特定的DNA碱基合成试剂喷洒到特定位置上，以固相合成的原理与支持物发生偶联，然后固定，冲洗，去保护，偶联，直至合成完所需长度的探针。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics分子印章原位合成法•分子印章的制备和压印过程如见图ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（三）合成点样•由具有多个微细加样孔的阵列复制器(arrayingandreplicatingdevice，ARD)或阵列器及由电脑控制的机器人来完成。•机器人准确、快速地将不同探针样品定量(0.25～1.0μl)点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为100～150μm斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。合成点样法分类•接触式点样•喷墨式打印定位准确，重复性好斑点大，大小分布不均，密度低。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics二、样品的制备及标记（一）样品的制备•样品的扩增在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增，以提高阅读灵敏度。•待测样品的标记多采用荧光标记（cy3、cy5和FAM）方法，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素检测法。荧光标记的优点•激发光谱与发射光谱之间的STOCK’s位移大，故分辨率强，灵敏度高•可以进行定量检测•避免放射性同位素好的污染。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三样品与基因芯片的杂交•本质：DNA探针与靶基因碱基杂交形成DNA双链或DNA/RNA杂合链。•影响因素：靶分子浓度探针浓度序列组成盐浓度杂交温度反应时间基因表达检测——低温，高盐，长时间突变检测——高温，低盐，短时间ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics四、杂交结果的检测•检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等。•荧光检测器激光共聚焦快速传输高质量图像，灵敏度高，分辨率好价格昂贵偶联装置照相机扫描速度快，价格便宜灵敏度低荧光显影法•完全匹配产生的荧光强度比存在一两个错配的高5-35倍•荧光强度与待测分子的含量呈线性关系•问题只要结合就会有阳性信号，无法确认是否完全匹配•解决方法使用多色荧光技术——不同靶基因使用不同激发波长的荧光标记物。芯片激光光源电子束分裂器聚焦小孔检测器滤光镜聚光镜物镜使用最广泛的是荧光显影法光纤DNA生物传感器微阵列•原理：将合成的氰尿酰氯活化的探针固定在光纤的末端，集成含有不同探针的光纤，形成传感装置，探针伸入样品中，信号由另一端的CCD检测。•优势方便，可在没有confocal的实验室中开展实验。五、杂交结果的分析•标准化：消除不同芯片，不同标记物的差异•数据精简：去掉无显要意义的数据•统计学分析：对数据进行分析归类，并进行统计学检验，保证器准确性•生物学意义分析：基于统计结果，研究其代表的生物学意义，得出相应结论•数据库：Genesist，AMADA，TIGR。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三、基因芯片技术在医学领域的应用•基因芯片技术的基本应用可以分为两个主要方面：•定量分析（主要指测序和突变检测）•定性分析（主要指对基因表达的研究）。基因功能研究•基因表达及调控的研究•基因突变和多态性的检测•DNA序列的测定•基因组及基因研究基因表达及调控的研究•基因芯片应用最广泛的领域•从整体上分析细胞基因表达状况，为了解与某些生命现象相关的基因表达提供有力的证据，对于基因调控以及基因相互作用机理的探讨有重要的意义基因突变和多态性的检测•利用基因芯片技术对一些突变点的定位、确认及分类是诊断基因疾病的基础。•寡核苷酸芯片能够检出变异位点，被代替的核苷酸