四X染色质标本制备及观察

实验四X染色质标本制备及观察一、实验目的1.掌握X染色质标本的制备方法。2.熟悉人体X染色质标本的制备原理和临床意义。3.了解X染色质的形态特征。二、实验用品人体口腔颊部黏膜上皮细胞、光镜、载玻片、盖玻片、牙签、吸水纸、擦镜纸；试剂：固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、乙醇（70%、95%、100%）5M的HCl溶液、香柏油、二甲苯、0.2%甲苯胺兰染色液。三、实验原理X染色质又称X小体或Barr小体，是女性细胞分裂间期核内的一种特有染色质。X染色质位于核膜边缘，一般呈三角形、半圆形或扁平形等，为异固缩小体。正常女性间期核X染色质出现率为10％～59％，数目为X染色体的数目减1。这一结构在口腔、阴道等部位的粘膜上皮中通过简单的染色方法就可以观察到。通过进一步计算X染色质阳性率，不仅可以在胚胎期较为准确的判断胎儿性别；当临床上怀疑有X染色体数目异常时，也可以作为辅助诊断方法，对于没有条件开展染色体检查的地区不失为一种经济实用的方案。5X染色质（X-chromatin）正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深，约为1微米大小的椭圆形小体，既X染色质。6正常女性有两条X染色体，男性只有一条X染色体（和一条Y），X染色体有数量差异。那么，位于X染色体上的基因产物是否存在差异昵？为什么只有女性才有X染色质而男性没有？为什么某一种X连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？Lyon假说，来解释上述问题。7莱昂（Lyon）假说X失活发生在胚胎生命早期失活是随机的失活是完全的失活是永久的和克隆式繁殖的也就是说在女性细胞中的两条X染色体只有一条有活性，另一条无转录活性，在间期细胞核异固缩而失活。这样男女X连锁基因产物量保持相同水平，这种效应称为剂量补偿。8需要说明的问题1）如果一个有缺失的X染色体，优先失活；2）常染色体和X染色体平衡易位的个体中，正常的X染色体优先失活；3）Xchr上的Gene不全部失活，约1/3的gene逃避失活，已知16个基因逃避失活；4）体细胞X失活是永久的，但在生殖细胞发育中，失活是可逆的；5）C中只有一条X染色体有活性，其他均以失活状态存在；四、实验方法受检者漱口后，用牙签刮取口腔粘膜上皮细胞，均匀涂在干净的载玻片上（约一张盖玻片大小），用记号笔标记细胞面，不等涂布干燥，立即放入3：1甲醇—冰醋酸固定液中，固定15分钟后取出玻片标本置于5MHCl中，水解15min，充分冲洗，除去多余的盐酸，0.2％甲苯胺蓝染液染色5min，分别置于70%、95%及无水乙醇中做脱水处理，晾干后镜检。五、结果与分析1.由于处于核膜内侧的X染色质在压片时可能被压在核的中央，这种情形下，X染色质容易与核中其它的着色的结构相混。为避免临床检测的误诊，计算X染色质时，只选择位于核膜内侧边缘、为核内唯一轮廓清楚的半圆形或三角形浓染小体。2.从理论上讲，正常女性的间期细胞中都应该有一个X染色质，但事实上由于染色方法、染色技术以及X染色质在细胞核中的位置不同，实际检查中不可能在每个细胞中都看到。六、作业1．画2～3个典型细胞，示X小体的形态和所处部位。