(2015年版药典)非无菌药品微生物限度检查操作规程

××××××××××公司GMP文件编码：SOP-QC-TY-02-033第1页共27页非无菌药品微生物限度检查操作规程起草人日期年月日执行日期2015年12月01日审核人日期年月日颁发部门质保部批准人日期年月日分发部门质保部（）份质检部（）份生产部（）份物资部（）份设备部（）份采供部（）份销售部（）份行政部（）份财务部（）份变更记载：修订号执行日期002012年06月01日012014年05月01日022015年12月01日1.目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。2.适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。3.责任者：QC检验员、QC经理。4.正文：4.1非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法4.1.1简述微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。××××××××××公司GMP文件编码：SOP-QC-TY-02-033第2页共27页4.1.2计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN法）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。4.1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。表1试验菌液的制备和使用试验菌株试验菌液的制备计数培养基适用性检查计数方法适用性试验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌(Staphylococcusau-reus)〔CMCC(B)26003)〕胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间18～24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30~35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeru-ginosa）〔CMCC（B）10104〕胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间18～24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)〔CMCC(B)63501〕胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度30～35℃，××××××××××公司GMP文件编码：SOP-QC-TY-02-033第3页共27页间18～24小时不超过3天，接种量不大于100cfu培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC(F)98001〕沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu黑曲霉(Aspergillusniger)〔CMCC(F)98003〕沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间5～7天，或直到获得丰富的孢子胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养（MPN法不适用），培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。4.1.4菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。菌液制备按表1规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。××××××××××公司GMP文件编码：SOP-QC-TY-02-033第4页共27页4.1.5阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。4.1.6培养基适用性检查微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1规定条件下培养。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。4.1.7计数方法适用性试验⒈供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。⑴水溶性供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。⑵水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。××××××××××公司GMP文件编码：SOP-QC-TY-02-033第5页共27页⑶油脂类供试品取供试品，加入经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃（特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释剂使成1∶10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用含适宜浓度的无菌聚山梨酯80或其他无抑制性无菌表面活性剂的稀释剂进一步10倍系列稀释。⑷需用特殊方法制备供试液的供试品膜剂供试品取供试品,剪碎,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制备成1∶10的供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂），置45℃水浴中,振摇,使溶解,制备成1∶10的供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。气雾剂、喷雾剂供试品取供试品,置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器从每一容器中吸出全部药液于无菌容器中混合，然后取样检查。贴膏剂供试品取供试品,去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨脂80或卵磷脂）稀释液的容器中，振荡至少30分钟。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。⒉接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释,制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。（1）试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。（2）供试品对照组取制备好的供试液,以稀释液代替菌液同试验组操作。××××××××××公司GMP文件编码：SOP-QC-TY-02-033第6页共27页（3）菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适应性试验。⒊抗菌活性的去除或灭活供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%，可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。⑴增加稀释液或培养基体积。⑵加入适宜的中和剂或灭活剂。中和剂或灭活剂（表2）可用于消除抗菌剂的抑菌活性，最好在稀释剂或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，试验