蛋白质 分离纯化主要方法

2020/2/251蛋白质分离纯化主要方法2020/2/252蛋白质分离纯化的一般步骤层析法电泳法超离心法超滤•盐析（硫酸铵盐析）•等电点沉淀•有机溶剂沉淀•透析│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│•材料选择与处理•细胞破碎（机械破碎、溶涨和自溶、酶解、化学处理）生物组织→无细胞提取液→粗产品→→结晶2020/2/253盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热变性沉淀法离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析等电聚集层析分离纯化方法沉淀法层析法电学法电泳法等电聚焦膜分离技术透析超滤离心法2020/2/254纯度鉴定分子量测定层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法(HPLC)电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等免疫化学法：专一的沉淀线SDS-PAGE电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一其它：如,结晶法……2020/2/255定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。操作蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂（如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于袋中而得到分离。一透析2020/2/256透析工作图半透膜原理2020/2/2572020/2/258二层析技术（chromatography）p148一、层析技术一般原理二、层析技术分类及应用2020/2/259（一）、层析技术原理层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：样品原点到斑点中心的距离Rf=——————————————样品原点到溶剂前沿的距离2020/2/2510(二)层析相关概念1.固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。2020/2/25112.流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。2020/2/2512（三）、层析法分类（按分离原理分类）分配层析吸附层析凝胶过滤（分子筛层析）离子交换层析亲和层析聚焦层析2020/2/2513层析法分类（按装置分类）纸层析薄膜层析柱层析2020/2/2514填充物分部收集玻璃柱洗脱液样品2020/2/2515各类层析的原理和载体类别分离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose6B）2020/2/2516原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。吸附层析（absorptionchromatography）2020/2/25172020/2/2518原理：分配层析是利用混合物(样品)在二种或二种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。分配层析(p148)2020/2/2519物质在纸上移动的速度可以用Rf表示：色斑中心至原点中心的距离Rf=──────────────溶剂前缘至原点中心的距离载体：纤维素硅藻土硅胶应用：各种生化物质的分离鉴定2020/2/2520凝胶层析（gelfiltration）又称为凝胶排阻层析（gelexclusionchromatography）、分子筛层析（molecularsievechromatography）、凝胶过滤（gelfiltration）、凝胶渗透层析（gelpermeationchromatography）等。2020/2/2521原理p303凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。2020/2/2522载体葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（sepharose）应用:测定分子量脱盐和浓缩分离提纯生物大分子除去热原物质2020/2/2523离子交换层析（ion-changechromatography）原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。2020/2/2524分类：根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，阳离子交换剂;阴离子交换剂；按其解离度的大小，分为强、中强、弱三种：2020/2/2525磷酸基团（PO3H2）和亚磷酸基团（PO2H）结合磺酸基团（SO3H）弱酸型强酸型中等酸型结合酚羟基（OH）或羧基（COOH）弱碱型强碱型中等碱型季胺基团（N(CH3)3），叔胺（N(CH3)2）、仲胺（NHCH3）、伯胺（-NH2）二乙基氨基乙基（DEAE）离子交换层析分类阴离子交换剂阳离子交换剂2020/2/25262020/2/2527交换过程2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2020/2/25282020/2/2529应用制备、纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分2020/2/2530原理欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L—S。其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M—L—S复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层桥方法称为亲和层析法。亲和层析（affiuitychromatography）2020/2/2531+待纯化分子配体a.待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子配体L基质M待分离物质SL-S复合物2020/2/25322020/2/2533应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex2020/2/2534聚焦层析（Chromatofocusing）该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。原理2020/2/2535pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。2020/2/25361、pH梯度的形成2、蛋白质行为3、聚焦效应2020/2/2537层析时的聚焦效应示意图pH梯度溶液的形成示意图蛋白质1（pI=7）蛋白质2（pI=8）流速移动速率2020/2/2538几种主要层析方法比较2020/2/2539二、电泳技术电泳的一般原理电泳技术的分类电泳的影响因素常用电泳技术2020/2/2540电泳的一般原理电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。2020/2/2541电泳分类•（一）按原理分四种•1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。2.自由界面电泳：这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。2020/2/2542（二）按支持介质的不同可分为：1.纸电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.琼脂凝胶电泳4.聚丙烯酰胺凝胶电泳5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。2020/2/2543（三）按支持介质形状不同1.薄层电泳；2.板电泳；3.柱电泳。（四）按用途不同可分为：1.分析电泳；2.制备电泳；3.定量免疫电泳；2020/2/2544（五）按所用电压不同可分为：1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。（六）按pH的连续性不同可分为：1.连续pH电泳：如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳；2.非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳；2020/2/2545电泳技术分类（按实验装置分类）纸电泳薄膜电泳凝胶电泳毛细管电泳2020/2/2546毛细管电泳2020/2/2547三、影响电泳的因素（一）带电颗粒的物理性状（二）支持物介质：（三）缓冲溶液(pH离子强度)（四）电场强度：（五）电渗现象：（六）焦耳热对电泳的影响2020/2/2548四、常用电泳技术1、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）3、SDS-PAGE4、PAGE等电点聚焦3、琼脂糖电泳4、毛细管电泳2020/2/2549聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶聚合反应及催化系统不连续PAGE可产生的三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应2020/2/2550•聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamidegelelectrophoresisPAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。2020/2/2551光聚合催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。聚合方式化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基2020/2/2552不连续表现：缓冲液及凝胶pH不连续凝胶孔径不连续电位