岛津操作培训-液相色谱基础知识

1ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited岛津液相色谱操作培训---基础知识岛津国际贸易（上海）有限公司分析中心2ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited免费咨询电话800-810-0439400-650-0439维修部010-85252375（北京）021-64451437（上海）020-87108631（广州）保税库010-85252353(Shanghai)Co.Limited1969GPC系统开发1972LC-1（LC-830）销售＜与DuPont签订许可合同后制造销售＞1978LC-3A系列销售＜CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征＞1981LC-4A系列销售＜内置微型计算机的全自动HPLC＞1982LC-5A系列销售＜世界上首创的微量型LC对应HPLC＞1984LC-6A系列销售＜世界上最早的积木型HPLC、现在的HPLC的前身＞1991LC-10A系列销售＜世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器＞1997LC-VP系列销售＜采用有效性支持功能的积木型HPLC＞2000LC-2010销售＜追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC＞2004LC-20AProminence销售＜为分析实验室带来革新的HPLC＞岛津HPLC的历史Startedin19691997THECNLOGYBREAKTHROUGHFlexibleHPLCSystemwithMicro-strokeVolumeSolventDeliveryUnitLC-VP2000THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20102004THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20AProminence4ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.LimitedLC-20AProminence5ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited第一部分色谱基础知识6ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素混合物色谱分离组分7ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited0.00.51.01.52.02.53.0min0100200300400500mVMethylParabenEthylParabenPropylParabenButylParaben•色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术•流动相：携带样品流过整个系统的流体•固定相：静止不动的一相，色谱柱色谱定义色谱是一种分离技术.色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量8ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited色谱分类™高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)™气相色谱GasChromatography(GC)™薄层色谱Thin-LayerChromatography(TLC)™毛细管电泳CapillaryElectrophoresis(CE)9ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited色谱优点•同时分析•分离性能好•灵敏度高(ppm-ppb)•进样量小(1-100uL)10ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法)适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析)流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用HPLCvsGC气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法)适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析)流动相只起运载样品分子的能力11ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.LimitedHPLC分类‹正相模式(NP-LC)‹反相模式(RP-LC)‹反相离子对色谱(IPC)‹离子交换色谱(IEC)‹尺寸排阻色谱(GPC/GFC)12ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited反相模式(RP)•C18(ODS)•C8(octyl)•C4(butyl)•苯基•TMS•氰基-Si-C18H37Si非极性非极性13ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited相互作用力是什么?OHOHC18(ODS)强弱疏水性疏水性Si14ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited疏水性•如果样品有–CH3CH2CH2---:碳链–:芳香基•如果样品有–-COOH:羧基–-NH2:氨基–-OH:羟基作用力强作用力强作用力弱作用力弱15ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited反相模式下流动相的选择优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要甲醇，乙腈和THF是常用的有机溶剂在有缓冲液的情况下,缓冲液的浓度和pH值非常重要16ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited增加流动相极性20%20%HH22OO30%30%HH22OO40%40%HH22OO1:对羟基苯甲酸甲酯2:对羟基苯甲酸乙酯3:对羟基苯甲酸丙酯4:对羟基苯甲酸丁酯有机相:MeOH17ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited固定相极性变化对分离的影响C18(ODS)强样品SiC8样品一般Si样品C4弱Si18ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited‹分析条件™柱:Shim-packCLC-ODS™流动相:MeOH:H2O=7:3™流速:1.0mL/min™温度:40C™进样体积:10uL™检测器:UV-254nm‹峰1.苯甲酸甲脂2.苯甲酸乙脂3.n-苯甲酸丙酯4.n-苯甲酸丁酯ODSC8ODSC8TMSTMS固定相极性变化对分离的影响19ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited离子对试剂•阴离子化合物–氢氧化四丁基铵–溴化四丁基铵•阳离子化合物–丁烷基磺酸钠(C4)–戊烷基磺酸钠(C5)–己烷基磺酸钠(C6)–庚烷基磺酸钠(C7)–辛烷基磺酸钠(C8)–癸烷基磺酸钠(C10)–十二烷基磺酸钠(SDS)离子对色谱20ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited离子对色谱影响因素•离子对试剂的类型•离子对试剂的浓度•流动相的pH21ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited正相色谱•硅胶柱:常用•氰基柱:常用•氨基柱:分析糖•二醇基柱:分析蛋白质硅胶SiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)化学键合相22ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited相互作用力是什么?OHHOSiOHSiOH强强弱弱非常弱非常弱氢键力氢键力23ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited氢键力•如果样品有–-COOH:羧基–-NH2:氨基–-OH:羟基氢键力强.•如果样品没有任何官能团，象碳水化合物•如果样品有大的基团,由于空间障碍氢键力弱.24ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited正相模式下流动相的选择•主要试剂–烷烃(戊烷,己烷,庚烷,辛烷)–芳香烃(苯,甲苯,二甲苯)–二氯甲烷–氯仿–四氯化碳•辅助试剂–甲基-t-丁基醚(MTBE),乙醚,四氢呋喃(THF),二氧杂环乙烷,嘧啶,乙酸乙酯,乙腈,丙酮,异丙醇,乙醇,甲醇为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。25ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited增加流动相极性0%0%MeOHMeOH2%2%MeOHMeOH5%/MeOH5%/MeOH1:邻苯二甲酸二辛酯2:邻苯二甲酸二丁酯3:邻苯二甲酸二乙酯4:邻苯二甲酸二甲酯主要试剂:己烷26ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited•反相–保留时间重复性好–固定相耐用•正相–对立体异构体有很好的分离(VitaminE等)–保留时间重复性稍差反相色谱与正相色谱的对比27ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited离子交换色谱N+RRR样品SO3-样品+++++++++++++离子吸引力28ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited离子交换色谱应用•生物领域(蛋白质,农药,氨基酸分析)•离子分析–阳离子交换剂•强阳离子交换剂(SCX)(R-SO3-)•弱阳离子交换剂(WCX)(R-COO-)–阴离子交换剂•强阴离子交换剂(SAX)(R4N+)•弱阴离子交换剂(WAX)(DEAE)29ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited尺寸排阻色谱法（SEC）流出顺序30ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited第二部分柱子基本性能参数31ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited硅胶纯度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸填料床的长度和内径颗粒形状球型或不规则型粒径平均颗粒直径,通常3-10µm表面积颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示孔径颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å碳百分率与基体物质相连的键合相的量封尾用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来表征色谱柱的参数32ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited表征色谱柱性能的参数•容量因子•理论塔板数•理论塔板高度•分离度•拖尾因子33ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited容量因子,k’t1=组分峰的保留时间t0=死时间(非保留时间)t0t1k’=t0t1-t034ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited理论塔板数,N中国/日本药典:N=5.54x(Rt/W1/2)2美国药典:N=16x(Rt/W)2WW1/2H1/2HRtArea理论塔板高度,HH=L/NL：色谱柱长N：理论塔板数35ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited分离度,Resolution相邻两峰完全分离其分离度Rs≥1.5.36ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited完全分离时的分离度Rs=1.0Rs=1.5峰形不是三角形峰形不是三角形，而是高斯分布，而是高斯分布37ShimadzuInternationalTrading(Shanghai)Co.Limited拖尾因子，TT=W0.05/2d0.05W0.05：5％峰高处峰宽d