第二章-微生物菌种选育

第二章微生物菌种选育黄小龙农学院生物技术系本章主要内容•第一节菌种的来源•第二节菌种选育•第三节微生物菌种的扩大培养•第四节菌种的保藏与复壮第一节菌种的来源一、工业发酵常见微生物种类1.细菌发酵工业常用的细菌大多是杆菌：枯草杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌、大肠杆菌等。4一、工业发酵常见微生物种类2.酵母菌发酵工业常用的酵母：酿酒酵母、异常汉逊氏酵母异常变种、假丝酵母属、毕赤氏酵母属等。5一、工业发酵常见微生物种类3.霉菌发酵工业常用的霉菌：曲霉属、青霉属、根霉属、毛霉属等。4.其他放线菌、担子菌、藻类等。6二、工业微生物来源•根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；•从大自然中分离筛选新的微生物菌种。•从一些发酵制品中分离目的菌株。三、微生物菌种的选择性分离•新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。•实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。•有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。1、分离思路：•定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。•采样：有针对性地采集样品。•增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。•分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌。•发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。2、新种分离与筛选的步骤（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选•2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。•3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表层5cm浮土，取离地面5-25cm处的土约10-25g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。采取土壤样品要考虑的几个问题•土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌。•离地面5~25cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含菌量最高。•采土季节以春秋两季最好。•采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被情况等。•多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分布平均情况。（二）增殖培养•含有目的菌较多的土样不需要富集培养。•如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分离。•富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的。•例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。某些细菌的富集条件富集对象接种菌样添加营养物(g)特殊培养条件好氧氨基酸氧化菌土壤–好氧，pH7.0好氧性芽孢杆菌土壤，巴氏消毒–好氧，pH7.0氨基酸发酵性梭菌土壤，巴氏消毒–厌氧，pH7.0耐碱解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒尿素50好氧，pH8.6厌氧八叠球菌土壤葡萄糖20厌氧，pH2~3乳酸菌植物体或牛奶葡萄糖20厌氧，pH6.5肠道细菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厌氧，pH7.0丙酸菌干酪乳酸钠20厌氧，pH7.0醋酸菌果实或生啤酒乙醇40好氧，pH6.0注：培养基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培养在30℃下。放线菌的分离15放线菌的特性：生长缓慢，难培养。分离要点：1）选择适合放线菌生长的培养基，如：HV培养基（腐殖酸培养基）。2）添加抑制其他细菌和真菌生长的抑制剂，如：重铬酸钾、放线菌酮、制霉菌素等。（三）培养分离•纯种分离的方法：划线分离法、稀释分离法。稀释分离法•稀释倒平板法•平板涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。•划线分离法——平板划线法（四）筛选1、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物筛选出来的过程。常用的初选方法：•水解酶产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培养基中，接种后适温培养，根据菌苔周围是否产生水解圈筛选出水解酶产生。一般采用平板筛选。•拮抗菌的筛选—对峙培养：将病原指示菌与待测菌株相对接种在平板上适温培养，根据病原菌的生长情况筛选出拮抗性菌株。2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取发酵滤液进行活力测定。2、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的生产能力强弱的过程。•复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法进行测定。•复筛过程中，要结合培养条件进行。培养条件包括：培养基pH值发酵温度供氧量等。（五）菌种鉴定•经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等。•现代多相分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组分、计算机数值分析。（五）毒性试验•自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。•据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第二节发酵高产菌种选育•菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种，从而促进生产发展。•目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。2.1自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。菌种的自然突变往往有两种可能性:1）菌种衰退,生产性能下降;2）代谢更加旺盛,生产性能提高。2.2诱变育种2.2.l诱变育种的基本原理诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。（1）染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。（2）基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变）。根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类，见P55(表2-1)。经诱变处理后，微生物的遗传物质、DNA和RNA的化学结构发生改变，从而引起微生物的遗传变异。2.2.2诱变育种的一般步骤1、出发菌株的选择•自然界直接分离到的野生型菌株。•经历过生产条件考验的菌株。•已经历多次育种处理的菌株。2、制备菌悬液•待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件；•尽可能选择孢子或单倍体细胞作为诱变对象，避免表型延迟。•表型延迟就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。3、诱变处理•根据诱变剂用量对菌体致死率的曲线选择合适的处理剂量。•一般突变率随诱变剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，突变率会下降。4、突变菌株的筛选（1）营养缺陷型突变株的筛选•生物合成途径的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。32（2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不能再和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此不再起反馈阻遏作用；编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力但仍具有催化活性，从而解除了反馈抑制。抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选。营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株。（3）组成型突变株的筛选•分批限量加入诱导物法，解除菌株对诱导物的依赖•交替培养法（4）抗性突变株的筛选•抗生素抗性突变•抗噬菌体菌株的选育•条件抗性突变•敏感突变2.2.3几种常见的物理、化学诱变剂的使用方法1）物理诱变剂：紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；特点：导致DNA断裂缺失，造成不可回复的缺失突变。诱变效率高，但它可能影响邻近基因的性能。紫外线是常用的诱变剂。2）化学诱变剂：碱基类似物（5-BU）、脱氨剂（羟胺、亚硝酸）、嵌入剂（吖啶类）等。特点：碱基类似物：取代相应碱基进入DNA链，具有很高的特异性，但回复突变率高，很少使用。脱氨剂：碱基脱氨或脱氮，引起碱基对转换，造成的遗传损伤较多。应用的范围较广，嵌入剂：引起移码突变。可以造成生化代谢途径完全中断。2.3杂交育种发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是，一个菌种长期使用诱变剂处理之后，其生活能力一般要逐渐下降，例如生长周期延长，孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，有必要利用杂交育种方法。杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。1、杂交育种的目的：1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）；2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种；4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。微生物杂交育种所使用的配对菌株称为直接亲本。由于多数微生物尚未发现其有性世代，因此，直接亲本菌株应带有适当的遗传标记。常用的遗传标记有颜色、营养要求和抗药性等。营养标记菌株（即营养缺陷型菌株）是最常用的遗传标记之一。所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。2、遗传标记2.4原生质体融合技术所谓原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质体）。两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。2.4.1原生质体融合的优越性原生质体融合技术有以下优点:（l）去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。即使是相同接合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，并可对原生质体进行转化和转染。（2）原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子。参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这足一般常规杂交所达不到的。（3）重组频率特别高，因为有聚乙二醇作助融剂。（4）可以和其他育种方法相结合，把由其它方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。（5）可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后使之融合，再在再生菌落中筛选重组子。这样往往可以提高筛选效率。由于以上优点，利用原生质体融合来培育工业新菌株已受到国内外普遍重视。2.4.2原生质体融合技术一般步骤1、选择亲株选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株；亲株带上遗传标记；测定