纯合体鉴定的原理及方法-

1.T-DNA插入突变体的鉴定T-DNA插入突变体从拟南芥资源中心（OhioStateUniversity，Columbus）索要。种子被播种在含有卡那霉素（Kan＋）的MS筛选培养基上，待萌发后10天左右，把生长正常的幼苗移置营养土中。然后取10天后的叶片提取DNA，PCR进一步鉴定。其原理如下图所示（图5-1）：LP，RP分别为基因的左边界和右边界，LB为T-DNA上的序列。用三条引物进行PCR扩增，结果如右图所示。用LP和RP扩不出条带，而用RP和LB能扩出条带的为突变体纯合株。图5-1突变体鉴定原理图纯合体鉴定的原理及方法图1：T-DNA插入的位置图2：纯合体鉴定所示条带Byusingthethreeprimers(LBb1.3+LP+RP)forSALKlines,usersforWT(WildType-noinsertion)shouldgetaproductofabout900-1100bps(fromLPtoRP),forHM(Homozygouslines-insertionsinbothchromosomes)willgetabandof410+Nbps(fromRPtoinsertionsite300+Nbases,plus110basesfromLBb1.3totheleftborderofthevector),andforHZ(Heterozygouslines-oneofthepairchromosomeswithinsertion)willgetbothbands.Theproductsizeshouldbe200baselargerifusingLBa1insteadofLBb1.3.However,theprotocolrequiresthesameorsimiliarTMvaluesforalltheLB,LPandRPprimers.纯合体鉴定共需两次才能判定是否是真正的纯合体。1.以LP+RP为引物：结果显示WT＆HZ（杂合体）能扩出如上图2示900BP的带2.以LBa1+RP/LBb1+RP为引物：结果显示HZ（杂合体）＆HM（纯合体）能扩出如上图2示410+N的带3.对比两次结果，以LP+RP为引物无条带而以LBa1+RP/LBb1+RP为引物能扩出条带的植株为纯合体。也可以先以LP+RP为引物选出那些无条带所对应的植株再以LBa1+RP/LBb1+RP为引物检测看能否扩出带，能扩出的表示为纯合体。