医学科研入门——科研设计和撰写申报书

医学科学研究入门2.科研设计与课题申请书的撰写Background–minireviewUnclearControversialNotreportedFurtherinvestigationShortcomingsHypothesisExperimentsConclusionFutureInvestigationSignificanceMethodResultsDiscussion科研设计科研设计•概论•医学科研的基本要素•科研设计的基本原则•科研设计的基本步骤•统计学设计定义医学科研设计是研究医学科学研究中如何科学、合理地安排实验因素，提高实验效应，及如何排除影响实验的非处理因素。考虑周全、设计合理的研究方案可收事半功倍之效，而设计不佳的研究方案常招致失败及时间、经费的浪费。专业设计：指运用专业理论知识和技术进行设计,主要是解决研究的有用性、独创性和科学性,以回答、解决科学问题，验证专业假说。统计学设计：运用数理统计学理论和方法进行设计,包括资料的收集、整理、分析全过程的统计学设想和科学安排，以保证样本的代表性和样本间的可比性,以最少的调查、实验观察例数进行高效率的统计分析，得出准确的结果和可靠的结论。专业设计错误•苏联一神经论权威设计了免疫抗体形成的神经反射机制的实验：他将动物后肢与躯体分离，仅保留由肢体传入躯体的神经干，然后在“离体”后肢注射抗原，不久将该神经干切断。过些时候动物血中出现特异性抗体。该权威认为特异性抗体是由于抗原作用于神经感受器经反射而形成的。•设计用动物急性感染实验模型研究Th1/Th2细胞在炎症中的作用。定义医学科研设计是研究医学科学研究中如何科学、合理地安排实验因素，提高实验效应，及如何排除影响实验的非处理因素。考虑周全、设计合理的研究方案可收事半功倍之效，而设计不佳的研究方案常招致失败及时间、经费的浪费。专业设计：指运用专业理论知识和技术进行设计,主要是解决研究的有用性、独创性和科学性,以回答、解决科学问题，验证专业假说。统计学设计：运用数理统计学理论和方法进行设计,包括资料的收集、整理、分析全过程的统计学设想和科学安排，以保证样本的代表性和样本间的可比性,以最少的调查、实验观察例数进行高效率的统计分析，得出准确的结果和可靠的结论。实验设计实验设计主要为了保证科研结果符合四个性：－有用性：目的性和可行性－独创性：先进性－可重复性－经济性科研设计•概论•医学科研的基本要素•科研设计的基本原则•科研设计的基本步骤•统计学设计是否主动施加干预?1.实验研究(干预):受试对象：人——临床试验（clinicaltrial）动物——动物实验（animalexperiment）临床试验：治疗——临床疗效实验预防——社区干预实验（communityinterventiontrial）2.调查研究(无干预):被动地观察、如实记录联系：调查研究可为实验研究提供线索，而实验研究还需要通过调查研究加以证实。实验研究的基本要素降压药高血压病人血压值处理因素受试对象实验效应三要素：1.处理因素；2.受试对象；3.实验效应其他因素其他效应处理因素(studyfactor，treatment)例：药剂、手术方法、毒物•抓住主要处理因素•区分处理与非处理因素•处理因素必须标准化处理因素是指外界施加于受试对象的因素，是在实验中需观察并阐明其效应功能的因素。单因素单水平表3-1细菌脂多糖对人外周血单个核细胞干扰素γ分泌的影响组别目的LPS观察LPS（1μg/ml）刺激后人外周血单个核细胞干扰素γ分泌水平对照溶剂（PBS），其他条件与实验组一致，排除非处理因素引起的变化单因素多水平孕激素对滋养细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响组别目的孕激素1×10-7mol/L观察不同浓度的孕激素对滋养细孕激素1×10-6mol/L胞表达基质金属蛋白酶-9的影响孕激素1×10-5mol/L空白对照排除非处理因素的干扰多因素单水平美托康对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用组别脑缺血再灌注美托康目的处理组++观察美托康对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用对照A假手术+观察美托康的影响对照B+-观察脑缺血再灌注的影响对照C假手术-排除手术的影响对照D不手术-排除其他因素的影响多因素多水平地塞米松抗过敏效应实验研究组别口服肌注目的处理组A0.1mg/kg口服小剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组B0.5mg/kg口服中剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组C1.0mg/kg口服大剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组D0.1mg/kg肌注小剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组E0.5mg/kg肌注中剂量地塞米松对过敏反应的作用处理组F1.0mg/kg肌注大剂量地塞米松对过敏反应的作用对照组G溶剂排除口服因素造成的影响对照组H生理盐水排除肌注因素造成的影响对照组I排除其他因素的影响受试对象(studysubjects)病例的选择：纳入标准、剔除标准动物的选择：种类、品系、年龄、体重、窝别、营养……离体器官、组织细胞分子•须对处理因素敏感•反应须稳定•体内外实验相结合invitro，invivo，exvivo人体实验常见的设计类型•病例报告为疾病的发病表现、机理及诊治提供详尽的感性资料。病例报告往往是识别新出现或不常见的疾病或疾病罕见表现的第一线索。•横断面研究包括普查和抽样调查。•病例对照研究回顾病例组暴露因素，通过与对照组进行比较，研究这些暴露因素的发生频率与某疾病之间的关系。(由果到因）•队列研究按照所研究人群是否暴露于某种因素将受试对象分为实验组和对照组，随访观察两组人群某病的发病率，判断暴露因素与疾病发病率的关系。分为前瞻性队列研究(由因到果）和回顾性队列研究。•临床试验临床试验中的受试对象一般采用随机化原则分为治疗组和对照组，观察治疗手段的疗效。动物分类•按微生物学要求，实验动物可分为4个等级：I级：普通动物II级：清洁动物III级：无特殊病原体动物（SPF）IV级：无菌动物（GF）•按照遗传学特性要求，实验动物也可分为4类：I类：近交系或称为纯系动物II类：突变系动物，包括转基因动物和基因敲除动物III类：远交系动物，又称封闭群IV类：杂交群或称异系杂交•家兔对体温变化十分敏感，宜选用做发热、解热及致热源检查实验。•观察避孕药对排卵影响的实验宜选用兔、猫；对具有雌激素活性的药物进行避孕药效研究，不能选用小鼠与大鼠。•以高胆固醇膳食饲喂兔、鸡、猪、狗、猴等动物，均可诱发高脂血症或动脉粥样硬化，而猴和猪的心脏冠状动脉前降支还形成斑块及大片心肌梗死，情况与人更为相似，故动脉粥样硬化实验多选用猪、猴及兔。•家犬的胰腺、胃较小，宜用于胰腺摘除术及胃肠道生理的研究。•大鼠无胆囊，不会呕吐，故不能用于胆功能观察；狗、猫、猴等动物呕吐反应敏感，适宜用于呕吐实验。•BALB/c小鼠与其他近交系相比，肝、脾与体重的比值较大，对放射线甚为敏感，故常用于制备单克隆抗体。•C57BL/6小鼠具有干扰素产量高、对放射物质中等耐受、补体活性高、易诱发免疫耐受等特性，是肿瘤学及免疫学研究的常用品系。•如遗传性高血压大鼠、糖尿病小鼠、自身免疫病小鼠等。•还可利用某些特殊缺陷型小鼠，如胸腺缺陷的裸鼠，由于缺乏T细胞，故可接种人肿瘤，用以筛选抗肿瘤药等。细胞•原代细胞：经特殊分离方法从胚胎、组织器官及外周血等初分离的细胞在体外培养。•传代细胞：经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。•细胞株：单细胞大量扩增后形成生物学特性稳定的克隆化细胞群，称为细胞株。包括正常细胞株和肿瘤细胞株。•基因缺陷和转基因细胞株。•悬浮细胞和贴壁细胞。用细胞做实验的优缺点•不受机体内环境因素影响，从而避免个体差异，有利于探讨各种物理、化学和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。•便于同时从细胞、分子与基因三个水平研究肿瘤细胞的结构、功能及癌变发生机制。•能长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。•能快速筛选抗癌药物，适宜进行耐药机制、信号转导的研究。•研究周期较短，经济。缺点：•不能完全反映体内状况，常与体内实验互相验证。•长期培养易改变原有的性状。•易发生支原体感染。优点：细胞库资源•ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，即美国细胞、菌种保藏中心，目前能提供3000余种细胞系、15000余种细菌和噬菌体、2500余种动植物病毒、700余种人癌细胞系。•CascadeBiologics,Inc.：该公司主要产品为人原代细胞，包括正常人皮肤细胞、心血管内皮细胞、角膜上皮细胞、黑色素细胞等。网址：•第四军医大学实验动物中心：该中心保存多种肿瘤细胞株。网址：•武汉大学中国典型培养物保藏中心：是国内较大且保存品种较多的细胞保藏中心。E-mail:[e-mail]•中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库：是国内较大且保存品种较多的细胞保藏中心。网址：•中山医科大学实验动物中心。•中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院。分子研究DNA、RNA和蛋白质常用的重要数据库为：•基因数据库（）•非编码RNA数据库（）•蛋白质数据库（或）•蛋白质组分析数据库（）分子研究•基因与蛋白分子的检测：单个、几个与芯片的检测；•基因多态性研究、SNP、微卫星等•基因组、蛋白组和代谢酶组的变化•基因和蛋白的调控、分子表观遗传学•基因和蛋白的结构•基因和蛋白的关系、蛋白与蛋白的相互作用实验效应(experimentaleffect)处理因素作用于受试对象的结果，通过观察指标表达。观察指标应相关联、客观、精确、灵敏、特异。1.客观性：主观指标和客观指标。2.精确性：准确度(accuracy)或真实性（validity）：观察值与真值的接近程度，受系统误差的影响(如灵敏度、特异度)。精密度(precision)或可靠性（reliabiliy）或重复性（repeatability）：重复观察时观察值与其均值的接近程度，受随机误差的影响（如一致百分率、Kappa值）。3.灵敏性和特异性：指标的互补性、可靠性和稳定性（标准化）科研设计•概论•医学科研的基本要素•科研设计的基本原则•科研设计的基本步骤•统计学设计试验设计的原则•对照的原则：-意义：消除系统误差，鉴别处理和非处理因素的差异-类型：空白对照、阳性对照、阴性对照、自身对照、相互对照•随机的原则：-对照组和处理组除处理因素不同外，其余应全部相同。-动物实验随机分组；观察切片也应随机选择视野•重复的原则：-随机原则可排除大部分非处理因素的影响，但不能全部消除；因此，有必要重复，以反映客观真实性。-表现为一定的试验样本数（人、动物、细胞株）对照(control)的原则对照的意义：①区分处理因素与非处理因素的效应，是比较的必要基础药物治疗例:老年性慢性支气管炎气候转暖,自然缓解②消除和减少实验误差处理组：对照组：比较结果处理因素非处理因素+处理效应+非处理效应非处理因素非处理效应处理因素处理效应直接凝集和间接凝集试验•诊断血吸虫、RA、钩端螺旋体阳性对照和阴性对照可监控方法的正确性和特异性对照的形式㈠空白对照(blankcontrol)：对照组不加任何处理因素。例如：试剂空白、血样空白、无酶解空白、底物空白等。包括：空白对照、实验对照、标准对照、自身对照、相互对照、历史对照对照的形式实验对照(experimentalcontrol)：施加每一因素均需设置对照+非处理因素对照（安慰剂对照）。含赖氨酸面包