细胞生物学实验指导

细胞生物学实验指导内蒙古大学生命科学学院生物系2细胞生物学实验指导目录一．显微镜的使用实验一、几种光学显微镜的使用实验二、参观电子显微镜及生物超薄切片标本制备二．细胞形态结构实验三、细胞大小的形态观察——测微尺的使用实验四、细胞活体染色技术实验五、植物细胞骨架光学显微观察实验六、胞间连丝观察三．细胞化学实验七、鉴定RNA的细胞化学方法——Branchet反应实验八、DNA显色的观察——Feulgen反应实验九、固绿染色法鉴定细胞内酸性蛋白与碱性蛋白实验十、多糖及过氧化酶的显示实验十一、核仁组成区的银染显示与观察四．细胞生理实验十二、细胞膜的通透性实验十三、细胞电泳五．细胞和组织培养技术实验十四、植物原生质体的分离和融合实验十五、植物细胞的培养与观察实验十六、动物细胞融合实验十七、动物细胞的培养与观察六．细胞化学成分的分离实验十八、细胞器的分离、纯化——细胞分级分离实验十九、荧光的细胞化学测定实验二十、细胞活力的鉴别3实验一几种光学显微镜的使用一、实验目的了解几种光学显微镜的结构、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通显微镜提高分辨力的方法。二、实验原理(一)基本原理一般实验室经常使用的光学显微镜都是由物镜、目镜、聚光器和光阑组成，普通显微镜它们的放大原理及光路图如下：AB物体．A1Bl第一次成像，A2B2第二次成像，Ol目镜．O2物镜，F1为Ol的前焦点，F2为O2的前焦点各种光学显微镜的光学放大原理基本相同，各种特殊用途的光镜不过只是在光源、物镜、聚光器等方面作了改动，或在其它方面增设了某些特殊的设备。(二)几种光学显微镜l、普通光学显微镜：普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。它适于观察一般固定的，有色的透明度较高的标本。其最大分辨力一般为0.2微米，从构造上可分光学、机械和电子三大系统。2、暗视野显微镜：暗视野显微镜是以丁达尔现象(Tyndallphenomenon)(即光的微粒散射现象)为基础设计的,它使用了特殊的聚光器进行斜射照明,因光源中心束不直入物镜，所以视野黑暗，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。暗视野显微镜可用增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0．2—0．004微米直径的微小粒子，但它分不清被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。而暗视野显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。确切地说，称暗视野显微镜为暗视野照明更为贴切。它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜。使视野背景暗黑，样品明亮的照明方法。3、相差显微镜：O2O1B1A1ABA2F1F2B24相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般由于被检物体(如不染色的细胞)所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨出这种差别的，只有在变相差为振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。相差显微镜是以光的干涉现象为基础设计的。与普通光学显微镜比较，它在聚光器和物镜上作了改动。用装有环状光阑的聚光器造成的空心光线柱，使直射光(背景)和衍射光(样品)分开。同时在物镜的后焦面上装有相板，使直射光和衍射光发生干涉，从而把我们肉眼不能见的相位差变为可见的振幅差，同时相板上装有吸收膜，吸收部分直射(或衍射)光以增加反差，使人们能够看清更加细微的结构。所以相差显微镜一般用于观察活细胞的细微结构。4、荧光显微镜：荧光是指某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活吸收能量后呈激发态，其能量部分转化为热量或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。荧光显微镜是以紫外线(3650A)或兰紫光(4200A)照射某些物质，可激发其产生荧光的原理为基础设计的，利用一个高发光效率的光源，经过一个滤光系统得到紫外光(或兰紫外光)，直接照射标本中的自然荧光物质，使其产生自发荧光，再加以镜检。或以荧光染料先对标本进行染色，然后使之在上述光源照射下产生次生荧光，再加以镜检。这种显微镜主要用于观察荧光(或次生荧光)物质在细胞内分布情况，以及测定细胞器的生理活性。(三)如何提高分辨力显微镜的能力是质量和性能的标志。能力包括分辨率、放大率、焦点深度和视场宽度等。其中最重要的是分辨率。各种能力都有一定的限界，既互相作用，又互相制约，改善和提高了某种能力，同时降低了某些能力，只能顾其主要，兼顾其它，综合筹统。1、数片孔径(numerialaperture)数片孔径(N．A．)也叫镜口率，是物镜和被检样品之间的介质的折射率(n)与物镜所接受的光锥顶角(亦称孔径角)的一半α(半孔径角)正弦的乘积。其公式如下：N．A．=n·sinα物镜的数值孔径愈大，显微镜的能力愈强，数值孔径与分辨率成正比，与焦点深度成反比．物镜的数值孔径的N．A．值刻在物镜壳上，如40／0．65表示40倍的物镜，数值孔径为0．65。物镜的数值孔径随前透镜直径的减少而增大。显微镜物镜的前透镜口径愈小，数值孔径愈大，放大倍数愈高，价格愈高。2、分辨率(resolvingpower)物镜分辨力是指分辨被检样品微细结构的能力。通常以能清晰地分辨两个物体点的最短距离来表示。其公式如下：R=0.61×λ/N．A．R：分辨率；λ：照射光线波长；N．A．：物镜数值孔径分辨率以分辨两个点的最短距离表示，R值愈小，分辨能力愈大。物镜的分辨率与照明光线的波长成反比，与物镜的数值孔径成正比。照明光线波长愈短，物镜的数值孔径愈大，显微镜的分辨率亦愈大。物镜的分辨力即显微镜的分辨率，目镜与显徽镜的分辨力无关，它只把物像第二次放大，使眼睛便于观察。目镜只能将物镜已经分辨的影像进行放大，无法观察到未被物镜分辨的细节。在光学成像过程中，目镜不起初始造像作用，仅作放大而已。3、放大率(magnification)5显微镜最后形成的物体放大影像，对被检物体的大小比例称为放大率，即像高比物高。放大倍数以长度计算，而不是以面积或体积计算。显微镜的总放大率(Mt)应为：Mt=Mob×Me×MphMt：总放大率；Mob：物镜放大率；Me：目镜放大率；Mph：摄影透镜放大率一般镜检观察时，摄影附加透镜的放大倍率不计算在内，因它未参予造像，显微镜辨别微细结构的能力，不取决于总放大率，而归于物镜的分辨率。显微镜的总放大率，绝非愈高愈好，有其适量范围：最低和最高界限。适宜的总放大率是所用物镜数值孔径的500～1000倍。在此范围称作有效放大率。例如：使用40／0．65物镜时，应选配适宜的目镜倍数范围。首先计算出有效放大倍率：0．65×500～0．65×1000=325—650再用物镜放大倍率除以有效放大率：325÷40～650÷40=8～16求得的数值是应选配的目镜放大倍率的范围，即要选用8×～16×的目镜。总之，总放大率超过物镜数值孔径的1000倍时，微细结构分辨不清，为空的放大，低于500倍时由于放大率过低，肉眼难以分辨。4、焦点深度(depthoffocus)当显微镜对被检样品的某一点或平面准焦时，影像的清晰范围，不局限于这一点或面，在某上下的一定距离或深度内也是清晰的。这段清晰的距离或深度，就叫做焦点深度，简称焦深，焦深长表示清晰的上下范围或深度大，焦深短，清晰的上下限界短。显微镜的焦深可变，它与物镜的数值孔径和总放大率相关。焦深与物镜的数值孔径和总放大率成反比，收缩孔径。影像的焦深加大，提高物镜的数值孔径，清晰深度变小，总放大率提高，焦深度小，总放大率降低，焦深加大。使用同一物镜，配用倍率的目镜，其焦深随目镜倍率加大而减少。三、实验用品：(一)材料：草履虫，洋葱内表皮，紫鸭趾草等花粉，菠菜叶。(二)用品：普通光学显微镜，暗视野显微镜。相差显微镜，荧光显微镜，载玻片，盖玻片，吸管，镊子，剪刀等。四、实验方法：l、观察草履虫的外形、运动、纤毛、食物泡等。取少许棉花纤维或擦镜纸纤维，放于载玻片上，在其上滴一滴草履虫悬液，然后加盖玻片观察。2、洋葱表皮细胞和菠菜叶的细胞核、叶绿体的观察在载玻片上滴一滴水，撕洋葱鳞茎内表皮或菠菜下表皮一小块放于其中，使其展开，然后加盖片观察。3、紫鸭趾草花粉外形、表面突起的观察在载玻片上滴一滴水，取紫鸭趾草雄蕊在其中沾几下，然后盖片观察。五、作业：1、谈谈如何提高显微镜的分辨力。2、根据实验结果，把所能观察到内容的材料符号填在表内适当的位置。6显微镜观察内容普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜细胞核核仁叶绿体线粒体液泡纤毛A、草履虫B、洋葱表皮细胞C、菠菜叶细胞3、通过实验简述所使用的几种显微镜的用途。7实验三细胞形态大小的观测——测微尺的使用一、实验目的：观察不同组织的细胞形态，了解它们与功能的关系，学会和掌握测微尺的使用。二、实验原理：细胞形态、大小种类繁多，差别较大，从形状上动物卵细胞、植物的基本组织细胞(薄壁细胞)是球形或近球形细胞。人的红细胞呈圆饼状，神经细胞分枝状，植物细胞执行不同功能，其形状差异很大。如输导组织细胞呈柱状，机械组织细胞呈棱形等。细胞的形态与其功能相适应。细胞的形态可以通过显微镜观察得以描述，而细胞的大小是通过一定的测量工具来获得较为准确的测量结果，下面介绍几种测量用的测微尺。l、镜台测微尺：是一种特制的载玻片，中央有刻度线的标尺，一般全长为lmm，共分l0个大格、100个小格，每一小格长度(0．01mm)，用加拿大树胶将圆盖玻片密封在载玻片上。2、目镜测微尺：是放在目镜筒内的标尺。我们使用的是固定式目微尺，为一块圆片玻璃片，直径20—2lmm，上面有刻度，分为直线式和网格式的。(1)直线式目微尺：用于测量被检物的长度，整个刻度一般长约10mm，分成l0个大格，100个小格。(2)网式目微尺：主要用于计算被检物的数目和测量物体的面积，方格大小各有不同。3、镜台标准推动器上的纵横游标尺：一些较高级的显微镜都有该装置，它可以用来测量被检物的长度和位置，由标尺和副标尺组成。4、微调焦轮的标尺：是在调上、下厚度时，微调焦轮读出的数值，一般有100个刻度，每一刻度为l一2µm。三、实验用品：l、0.5％蕃红或l／3000中性红溶液2、香柏油，二甲苯3、兔的肝、肾、卵细胞永久制片4、蚕豆根尖切片．洋葱新鲜材料四、实验步骤：(一)台微尺和目微尺的校对1、卸下目镜，拧开后面的透镜，将目微尺装入其焦面上，使刻度向下。2、将台微尺置于载物台上，使刻度向上。3、调焦至能看清台微尺刻度线。4、移动台微尺，并转动目微尺，使两个测微尺的左边第一条刻度线完全重合，然后向右边找完全重合的刻度线。分别记录两重合线间台微尺刻度数n和目微尺刻度数m，并查出台微尺的实际刻度值a(一般为0.0lmm)。5、计算目微尺的实际刻度值x(mm)X=n·a/m6、校对后，卸下台微尺进行细胞形态、大小观测，如果物镜倍数改变，需进行重8新校对。(二)细胞形态观察和细胞大小的测量1、兔不同组织细胞永久制片观察其细胞间隙、细胞形状、细胞核及核仁形状与数目、细胞质的形态结构等。2、．蚕豆根尖的永久制片观察蚕豆根尖纵切面概况，注意生长点与生长点成熟区细胞的异同。3、大肠杆菌标本示范，注意细胞形状、大小及核物质等情况。4、细胞大小的测量对于圆形椭圆形细胞或正方形细胞，它们的直径、长、宽可以用目微尺进行测量，对于长方体的细胞来说，算出体积要有一厚度的问题，它是不能用目微尺测量的，而需要用显微镜微调焦轮上的标尺，具体方法如下：(1)将微调“O”刻度与基部镜臂上刻度线对准。(2)转动粗调看清细胞的上端面或下端面；然后顺时针或逆时针旋转微调，看清细胞的下端面或上端面，计下微调旋过的刻度数L，则厚度为：h=L．b(b为微调每转一刻度，物镜垂直下降的距离一般显微镜都给出了)5、求核质比NP核质比的计算=Vn(核体积)/Vc(细胞体)-Vn（核体）注：椭圆体积v=4／3πab2圆球体积v=4／3π长方体V=a．b．c(1)兔肾细胞的永久制片求NP值。(2)洋葱内表皮细胞，用0.5％蕃红染色5分钟观察，求NP值。五、作业1、通过观察，说明真核细胞和原核细胞，植物细胞和动物细胞在形态结构的复杂性