2016.5梅毒检测技术

梅毒实验室检测湖南省疾病预防控制中心贺健梅2016年5月预防控制艾滋病、梅毒主要措施•检测、治疗–孕产妇艾滋病、梅毒和乙肝检测率达95%以上，孕期检测率达90%以上，提高孕早期检测比例。–艾滋病感染孕产妇抗艾滋病毒用药率达90%以上，所生婴儿抗艾滋病毒用药率达90%以上。–梅毒感染孕产妇梅毒治疗率达90%以上，所生儿童预防性治疗率达90%以上。–艾滋病母婴传播率下降至5%以下。–先天梅毒报告发病率下降至15/10万活产以下。•推行医务人员主动提供艾滋病、梅毒检测咨询策略（三个90%）–各级医疗机构应进一步增强艾滋病、梅毒咨询检测服务意识，主动宣传开展HIV、梅毒检测的益处，坚持“知情不拒绝”原则，规范开展医务人员主动提供艾滋病、梅毒检测咨询（PITC）服务，扩大检测覆盖面，及早发现传染源，并为其及时提供预防服务和治疗关怀，防止二代传播。梅毒实验室检测目的•发现梅毒感染者•梅毒疗效判断梅毒检测技术要点相关问题•一旦感染梅毒，梅毒螺旋体特异性抗体常终身阳性？•RPR/TRUST只能用于梅毒初筛？•二期梅毒时，TPPA和RPR两种血清学试验100％阳性？•TPPA（-）/RPR（+）结果一般可排除梅毒螺旋体感染？•TPPA是梅毒螺旋体抗原检测试验检测方法的“金标准”？•病人接受梅毒第一次初筛可采用任何一种血清学检测方法？•TPPA是梅毒血清学检测确证方法,所以TPPA（+）即可诊断为梅毒？•RPR和TRUST的方法原理相同，所以两种方法的定量试验结果相同？•TPPA（+）/RPR（-）可能是极早期梅毒？•RPR试验假阳性即表明被检测标本中不存在梅毒螺旋体非特异性抗体？梅毒病人的自然病程与检测诊断依据病史症状实验室检查感染梅毒螺旋体一期梅毒二期梅毒梅毒三期梅毒终生潜伏梅毒2-6周2-50年28%常用梅毒实验室检测方法•病原学检测•血清学检测病原学检查•方法：病原学检查的主要方法有–暗视显微镜检查–镀银染色法病原学检查的临床意义•病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作的特点。•螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。•如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性，梅毒血清学检测方法•两类方法–非梅毒螺旋体抗原血清学试验（非特异性梅毒抗体）–梅毒螺旋体抗原血清学试验（特异性梅毒抗体）。非梅毒螺旋体抗原血清学试验•梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。•未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。•方法包括：–快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)–甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）–性病研究实验室试验(VDRL)等。•基本成分是心磷脂卵磷脂和胆固醇•抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见••上述方法的敏感性和特异性都基本相似非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点•1、仪器：水平旋转仪，转速？转幅？•2、定性试验•加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内•加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原•反应：水平旋转仪旋转8分钟(23℃-29℃），亮光下观察结果•100r/min约18mm•3、定量试验–稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开–加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。问题：定量试验血清稀释需要使用试管吗？•下同定性试验。定量试验结果判断血清稀释度结果？1:21:41:81:16+----？++---？++++-？？1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:512问题：定量试验原倍血清滴度是多少？非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义•早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后–一期梅毒1年后转为阴性–二期梅毒2年后转为阴性。–晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。•非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。•因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。梅毒病期敏感性(%)特异性(%)一期86（77-99）-二期100隐性98(95-100)（一般滴度1:8，但不排除1:8）晚期73非梅毒-98(93-99)非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点•假阳性反应–技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可排除。–生物学假阳性反应(一般滴度小于1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA等进行排除。梅毒螺旋体抗原血清学试验•抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。•感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。–问题：梅毒螺旋体抗原血清学试验的定量试验在梅毒诊疗中有意义吗？梅毒螺旋体抗原血清学试验方法•梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)•梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)•梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）•化学发光免疫分析法（CLIA）•梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)•荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）•梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）TPPA•TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性和特异性。•TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“金标准”，常用于新方法、新试剂的参照标准。ELISA/CLIA•ELISA试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。–本法可用于大样本血清检测。•化学发光法的临床应用意义基本同ELISA梅毒免疫层析快速检测方法（全血法）梅毒免疫层析快速检测方法（血清、血浆法）梅毒快速检测新进展梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义•作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)初筛阳性标本的确证试验，排除RPR假阳性。•不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断。•TPPA等梅毒螺旋体抗原血清试验不能作为疗效观察的指标。梅毒血清学试验结果解释（梅毒临床诊断参考依据）试验结果参考结果解释*梅毒螺旋体抗原血清试验非梅毒螺旋体抗原血清试验阳性阳性可能为现症梅毒阴性阳性非梅毒螺旋体血清试验假阳性阳性阴性临床治愈的早期梅毒（既往感染者）或极早期梅毒阴性阴性排除梅毒感染或极早期梅毒梅毒血清学试验基本实验室设备检测方法检测样本类型必要设备血清血浆全血RPR/TRUST√√水平旋转仪TPPA√√震荡仪ELISA√√酶标仪、洗板机快速检测√√√无需特殊设备梅毒实验室检测策略解读？RPR：初筛试验TPPA：确证试验非梅毒螺旋体抗原血清学试验梅毒螺旋体抗原血清学试验排除试验假阳性确证梅毒螺旋体现症感染排除治愈的既往感染者确证梅毒螺旋体现症感染梅毒实验室检测流程•孕产妇初次接受孕产期保健时，即采用任意一类梅毒血清学检测方法进行梅毒筛查。筛查结果呈阳性反应者，需用另一类检测方法进行复检，确定其是否为梅毒感染。在有条件地区，建议首选梅毒螺旋体抗原血清学试验进行筛查。非梅毒螺旋体抗原血清试验（如RPR）阳性阴性RPR定量试验梅毒螺旋体抗原血清试验（如TPPA）报告：RPR阴性阳性阴性报告：RPR阳性及滴度TPPA阳性报告：RPR阳性TPPA阴性梅毒螺旋体血清试验（ELISA））阳性阴性RPR定性/定量试验报告：ELISA阴性阳性阴性报告：ELISA阳性RPR阳性及滴度报告：ELISA阳性RPR阴性推荐TPPA复检报告：ELISA阳性TPPA阳性RPR阴性报告：ELISA阳性TPPA阴性RPR阴性回答•一旦感染梅毒，梅毒螺旋体特异性抗体常终身阳性？•RPR/TRUST只能用于梅毒初筛？•二期梅毒时，TPPA和RPR两种血清学试验100％阳性？•TPPA（-）/RPR（+）结果一般可排除梅毒螺旋体感染？•TPPA是梅毒螺旋体抗原检测试验检测方法的“金标准”？•病人接受梅毒第一次初筛可采用任何一种血清学检测方法？•TPPA是梅毒血清学检测确证方法,所以TPPA（+）即可诊断为梅毒？•RPR和TRUST的方法原理相同，所以两种方法的定量试验结果相同？•TPPA（+）/RPR（-）可能是极早期梅毒？•RPR试验假阳性即表明被检测标本中不存在梅毒螺旋体非特异性抗体？质量控制与管理•质量管理：指挥和控制一个组织在质量方面的相互协调的活动。–质量策划：致力于制定质量方针、目标并规定必要的运行过程和相关资源以实现质量目标–质量控制：致力于满足质量要求–质量保证：致力于提供质量要求会得到满足的信任–质量改进：致力于增强满足质量要求的能力（PDCA）•质量控制是质量保证的基础和前提影响质量的关键因素与控制•人、机、料、法、环一）影响检测质量的关键因素与控制（一）人----人员•1、分类：–管理人员和关键岗位人员：（是按单位质量体系和认证认可准则要求设置的）如质量监督员、样品管理员、复核员、授权签字人–实验辅助人员，包括后勤保障员、消毒员、设备和样品管理员等–检验技术人员。•2、基本能力–学历：应具有专门学历（原则上应具有本科及以上学历），具备基本专业知识、实验技能–岗位能力与资质：•普通资质：两种考核上岗证，专业知识和技能上岗证；实验室生物安全培训合格证。•特殊资质与能力认定：特种压力设备操作合格证（质量技术监督部门）。–持续培训–健康监护个人健康档案、预防性接种（二）机----仪器设备维护与管理•1、设备的一般管理原则–新购仪器设备的安装与确认：核查与申购要求的主机、配件(包括软件等备件清单)、资料的一致性和齐全性。–登记和编制基本信息：登记仪器名称、型号、生产厂商、生产日期、管理编号(唯一号)、使用部门和地点等。–收集或编译使用说明书和维护保养手册，编制作业指导书。–对重要设备使用人培训和使用授权，如高压灭菌器、酶标仪等。–制定使用规程和保养制度(包括清洗规程)，建立使用和维护记录。–涉及计量要求和对检验质量与安全有重要影响的设备，应制定实施首次和周期检定胶准或性能验证计划。–按准则要求建立仪器设备档案，并确定保管地点和人员。–状态管理：实验室所有设备均应实施状态管理，经过检校、核查验证或常规运行判定，对合格、降级准用、不合格设备实行明确的状态标志管理，避免误用。–检定校准证书的应用：实验室应对检定校准证书或验证核查报告进行确认，一是确认设备满足要求，二是对证书报告涉及的修正因子进行应用，如各类温控装置的温度计检校参数与日常监控温度的一致性。•2、常见设备的检校、性能验证和维护–无需校验设备：为不涉及计量、对实验过程和结果准确性没有直接影响、只需专业人员判定运行正常的设备，如样本震荡混匀器、真空泵等基础实验设备，只要确认运行正常并满足实验要求，即可作为合格状态进行标识。–检定校准类设备：该类设备或设备部件需要定期检定、校准或核查合格后，方可投入使用，包括：天平、砝码、温度计(表)、高压灭菌器、微量移液器、酶标仪、温湿度计(表)、恒温培养设备等•洗板机每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；•酶标仪经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。（三）料----试剂和耗材•一、试剂•必须使用经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、在有效期内的试剂，•储存条件：冷藏？室温？–ELISA试剂–快速试剂。1）购买：评估合格供应商工作。•2、验收：–形式验收：生产厂家、品名及产品编号、包装完整性、批号/生产日期、有效期、外观符合性（即用型培养基)、\数量、储藏条件、厂商质量证明文件–实验验收：实验室在验收时可对部分指标性能进行测试。–验收结果：保存相关记录并作为定期合格供应商评价依据。•3、日常管理–出入库–按