2015免疫学实验方法

[e-mail]免疫学试验方法免疫识别和清除抗原性异物可能有利，也可能有害免疫系统具有区别“自己”和“非己”的能力免疫耐受免疫应答免疫学检测与免疫学技术一、抗原抗体的检测技术二、免疫细胞的检测三、细胞因子的检测-ELISA四、免疫组织化学五、免疫印迹技术–WesternBlotting六、流式细胞术七、PCR技术八、基因沉默技术免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。免疫学技术的应用极为广泛，疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。一、抗原抗体的检测技术(一)细胞计数—细胞计数板*准备细胞计数器：70%乙醇→制备单个细胞悬液：贴壁细胞需胰酶消化→加样→细胞计数：100倍镜下观察，“计上不计下，计左不计右”二、免疫细胞的检测对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定细胞密度：每毫升培养基中活细胞的个数=每个方块内细胞的平均数×细胞稀释比例×1041mm2×0.1mm=0.1mm3=10-4cm3=10-4ml(二)免疫细胞功能的测定1．T细胞功能测定（1）T淋巴细胞增殖试验：T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后可发生增殖，可通过以下三种方法检测。1）形态计数法2）3H-TdR或125I-UdR掺入法放射性元素washStimulateAssay3）MTT（噻唑蓝）比色法MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速度越快，则甲簪生成的量越多，吸光度越高；细胞毒性越大，则甲簪生成的量越少，吸光度越低。1.细胞的增殖和细胞毒实验，一般可在96孔细胞培养板中进行。2.每孔加入100微升细胞悬液。细胞的数量取决于实验目的和培养时间。增殖实验每孔通常加入103个以上数量的细胞；细胞毒性实验每孔至少加入5x103个或以上数量的细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素确定)。3.接种的细胞按照实验需要，送入细胞培养箱进行培养。增殖实验通常要给予0-10微升特定的药物或生长因子进行刺激。细胞毒实验通常要给予0-10微升抑制因子或细胞毒药物；4．培养结束后，每孔加入20微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育3－6小时；5．孵育结束后，每孔加入100微升甲簪溶解液，在37℃细胞培养箱内再继续孵育，直至在镜下观察甲簪全部溶解。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会略长。6.在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片，560-600nm范围的滤光片均可使用。MTT实验流程（2）迟发型超敏反应（DTH）的检测：此方法为体内检测细胞免疫功能的简便易行的皮试方法。其原理是外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血、渗出，于24~48小时发生，72小时达到高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的可发生水肿，甚至坏死。2．B细胞功能测定B细胞受多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定B细胞功能的最主要的方法。（1）B淋巴细胞增殖试验：LPS或PWM刺激（2）B细胞产生抗体能力的检测：1）ELISA检测培养上清中抗体的量。2）ELISPOT（酶联免疫斑点法）可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。详细见后述3．细胞毒试验细胞毒实验技术是检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。Targetcell51CrlabeledTargetcellCTLTargetcellCr51releaseAssayCTL51Crrelease（1）放射性核素释放法：(51Cr、125I—UdR)（2）乳酸脱氢酶释放法：细胞受损，LDH释放，LDH在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成NADH。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm或570nm波长处读取的OD值，经计算即可得NK细胞活性.（3）MTT比色分析法4．吞噬功能测定（1）硝基蓝四氮唑试验：硝基蓝四氮唑（NBT）是一种水溶性的淡黄色染料。由于在杀菌过程中产生反应性氧中间物（ROI），其中超氧阴离子（O2-）能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数NBT阳性细胞，可反应中性粒细胞的吞噬功能。（2）巨噬细胞吞噬试验：将待测巨噬细胞与某种可被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞）混合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。三、细胞因子的检测•基础:抗原或抗体的固相化抗原或抗体的酶标记•用途：目标蛋白的定性或定量分析**酶联免疫吸附试验-ELISAEnzymeLinkedImmunosorbentAssayELISA三个必要试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）;（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。a.包被b.抗原抗体反应c.酶促反应,显色d.终止显色，读取数据。ELISA基本的实验过程：对照和标准曲线：阳性对照阴性对照定量测定：标准品制作标准曲线待测样品的合理稀释用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：双抗体夹心法测抗原（常用）•夹心法双抗原夹心法测抗体•间接法测抗体（常用）竞争法测抗原•竞争法竞争法测抗体•捕获包被法测抗体•亲和素-生物素ELISA法双抗体（原）夹心法测抗体包被抗原*酶标抗原待测抗体包被抗体*酶标抗体待测抗原Anti-HIV,Anti-HBs双抗体夹心法双抗原夹心法HBsAg,HCVcoreAg,HBeAg,HBVpreS1,PreS2包被特异性抗体加入待测样品加酶标特异性抗体底物显色洗涤洗涤孵育洗涤孵育☆双抗体夹心法测抗原步骤☆双抗体夹心法测抗原特点•抗原浓度过高出现钩状效应（Hookeffect）:所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性结果。•双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。间接法测抗体☆间接法是检测抗体最常用的方法。☆原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。☆操作步骤：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤。（2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。☆间接法的特点•本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。•间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。•间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。ELISPOT（酶联免疫斑点法）方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与班上的抗原结合。加入二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。此法的主要优点是:①稳定、特异，且抗原用量少；②与ELISA联合使用，可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量测定；③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。四、免疫组织化学Immunohistochemistry原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶）用途：组织或细胞内抗原的定性和定位流程：免疫荧光技术（immunofluorescence，IF）•定义：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。•原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原（抗体）标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光标记物作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。结果判断•设立实验对照:阳性对照和阴性对照•阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型Figure3.mTNFinducesinfiltrationofinnateimmunecellsandangiostasisintumorsfromTNFR1–/–butnotTNFR1–/–/R2–/–mice.andCD31+(EandF)cellsasindicated.GandH,forconfocalmicroscopyanalysis,tissuesectionswerestainedwithCy3-labeledanti-CD31forbloodvesselendothelialcells(green)andtheVasoTACSinsitukittodetectapoptosis(red).Arrows,apoptoticendothelialcellsinthetumor.TNFR1–/–TNFR1–/–/TNFRR2–/–•成败的关键因素：组织的固定、包埋抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间）非特异性抗原的封闭内源性酶或自发荧光的消减显色思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？五、免疫印迹技术–WesternBlotting（分子生物学实验方法）一.蛋白质样品的提取分离二.蛋白质样品的定量三.制备SDS－PAGE胶四.转移电泳及免疫印迹五.结果分析-用WesternBlot图片灰度分析软件imageJ或QuantityOne免疫学三大工具比较•免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。•ELISA用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。•免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度非常高。•WesternBoltting先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。ELISA与WesternBlotting比较•WB可以看到特异性的条带，但是定量比较麻烦；•ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信；•WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到；•WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测；•WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而ELISA无能为力；•WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。免疫共沉淀（Co-IP)•用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相