核酸分子杂交2016

董燕免疫学研究室及分子生物学技术实验室核酸分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交分子：杂交后形成的异源双链分子杂交双方分别称为探针与待测核酸。目的:检测核酸序列特点：高度的灵敏性(pg)、高度的特异性应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。检测对象:克隆化的基因组DNA、细胞总DNA、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。第一节核酸分子杂交的基本原理DNA变性、复性与分子杂交Hybridization一、变性（denaturation）二、复性（renaturation）三、杂交（hybridization）四、预杂交（prehybridization）一、DNA的变性(denaturation)定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失DNA变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。目录Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(meltingtemperature,Tm)。其大小与G+C含量成正比。Tm：50%DNA解链的温度，又称融解温度。寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和核酸的序列决定了探针的Tm值。G、C含量越高，Tm越高二、DNA的复性DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低。DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子复性的速度受到诸多因素的影响：1.DNA的浓度：DNA的浓度直接影响到DNA单链间碰撞的机率，DNA浓度越大，复性速度越快。2.DNA的分子量：大分子量的DNA扩散速度较慢，也难于形成正确配对，因此复性速度较慢。3.温度：适宜的复性温度是较Tm值低25℃。4.离子强度：离子强度过低，不利于复性。5.核酸分子的复杂性。三、杂交（hybridization）2．影响核酸分子杂交的因素：•核酸分子的浓度和长度•温度•离子强度•变性剂（甲酰胺）•核酸分子的复杂性•非特异性杂交反应1．概念：来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。杂交温度：温度一般选择低于Tm值20-25℃Tm=81.5℃+161.6logM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺%）M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为50%，杂交体系中含5XSSC（0.75mol/LNa+）和50%甲酰胺，则其Tm值为：Tm=81.5℃+(-2.07)+20.5–1–30.5=68.4℃杂交温度应:68.4℃-25℃=43.4℃第二节核酸探针probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。核酸探针的类型核酸探针的标记物核酸探针的类型基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针常用的探针标记物：放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。优点：高特异性，高灵敏度缺点：存在放射性污染，半衰期短非放射性同位素：荧光、地高辛、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。核酸分子杂交信号的检测放射性同位素标记探针放射自显影非放射性同位素标记探针偶联反应+显色反应检测杂交信号放射自显影检测杂交信号放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来检测杂交信号。取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒内，-70℃曝光适当时间（1-7天），在暗室中取出X线片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。非放射性标记探针：偶联反应+显色反应Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联Dig-DNA探针+抗Dig抗体-碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）+底物：BCIP+NBT蓝紫色或DAB红棕色；TMB蓝色核酸分子杂交技术（nucleicacidmolecularhybridization）是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。探针(probe)：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。第三节核酸分子杂交技术核酸分子杂交↓固相杂交液相杂交膜上印迹杂交核酸原位杂交核酸分子杂交的分类一、膜上印迹杂交印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。常用的固相支持物：硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等特点：较强的结合核酸的能力（10μg/cm2）指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。操作步骤：预杂交杂交洗膜：洗去膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子的过程。1．印迹方法Mechanicsoftransfer虹吸印迹法（Capillary）真空转移法（Vacuum）电转移法（Electrophoretic）BlotDNAtomembraneCapillaryBlotting(upward)nospecialequipmentrequired!1975年E.SouthernSouthernDNA印迹转移技术DNA片段1kb，1小时DNA片段15kb，18小时Electrophoreticblotting不宜用硝酸纤维素膜一般2~3小时，最多6~8小时especiallygoodforsmallfragmentsresolvedbyPAGE2.预杂交prehybridization概念：为了减少探针与膜的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。常用的封闭物：（1）变性的非特异性DNA:如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。（2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400、脱脂奶粉基本实验步骤：electrophoresisTransferBlockblocksubstrateprobeMigrationhybridizationVacuumblotting30~60分钟–moreefficientandquantitativethancapillary–mustapplyvacuumevenlyandnottoostrongly3．印迹类型•Southern印迹杂交（检测靶分子为DNA,检测是否含有目的基因）•Northern印迹杂交•斑点及狭缝印迹杂交•反向斑点杂交•菌落或噬菌斑杂交提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜与DNA或RNA探针杂交放射自显影Southernblottinghybridization预杂交PaperTowelsSouthernBlottinghybridizationtissueSDSProtKPhenolChloroSpin提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性、转移到NC膜与DNA或RNA探针杂交放射自显影检测靶分子DNA。检测靶分子是否含有目的基因。可用于基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。DNA指纹图谱•Southern印迹杂交的应用：Northernblottinghybridization检测靶分子为RNARNA极易被RNase降解RNA酶抑制剂0.1%DEPC处理水(焦碳酸二乙酯)与Southernblottinghybridization不同之处：不需要限制性核酸内切酶酶切。变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。应用：检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。NorthernblottinghybridizationpancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNANorthernblottinghybridization优点：简单、迅速（直接点样）；可在同一张膜上进行多个样品的检测；应用：同一种样品经不同倍数的稀释,可以得到半定量的结果；核酸粗提样品的检测效果也较好。Dotandslotblottinghybridization将变性后的DNA或RNA直接点样与膜上Reversedothybridization直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同源序列。•DNAchipColonyorphagehybridization从重组DNA文库中筛选阳性克隆二、核酸原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片中核酸进行杂交检测的方法。在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列在染色体中的精确定位；探针与细胞内RNA进行杂交，观察该组织细胞中特定基因的表达水平；用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进行杂交，确定有无该病原体的感染。应用：