核酸分离纯化

2.基因组DNA的分离与纯化第六章核酸的分离与纯化1.核酸分离纯化的原则4.RNA的分离与纯化主要内容3.质粒DNA的提取与纯化核酸的分类、分布及意义概述核酸分离纯化的意义核酸的存在方式：DNP、RNP核酸的结构特征PaperTowels核酸分离的技术路线1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpin第一节核酸分离与纯化的原则材料与方法的选择原则技术路线的设计核酸的鉴定与保存实验要求：1.质量高:完整性、产量、纯度和浓度符合实验要求；2.方法好：简便快速、安全、经济；3.标本易得:血液、尿液、组织切块、培养的细胞和细菌等。一、材料与方法的选择核酸完整性的保持：1.避免过酸和过碱环境，pH在4-10之间；2.避免高温破坏，0-4C进行；3.简化步骤，缩短时间，减少破坏；4.抑制DNA酶和RNA酶的活性:用EDTA、柠檬酸盐络合Mg2+、Ca2+等离子。二、技术路线的设计核酸的释放：1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA的提取；2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。核酸的分离与纯化：1.除去蛋白质、多糖、脂类等大分子物质；2.除去非目的核酸组分：3.除去实验溶液和试剂：核酸的浓缩、沉淀与洗涤：1.浓缩：提高样品浓度；2.沉淀：常用的浓缩方法，如醋酸钠、醋酸铵等3.洗涤：除去共沉淀的盐，常用70%-75%的乙醇。三、核酸的鉴定与保存浓度鉴定：1.紫外分光光度法：原理：紫外吸收特性粗略定量：1OD相当于50g/ml双链DNA，38g/ml单链DNA或单链RNA，33g/ml单链寡聚核苷酸；准确定量：摩尔消光系数法计算盐溶液的影响：测定A310校正适用浓度：大于0.25g/ml2.荧光光度法：原理：荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromideEB）嵌入碱基平面，在紫外光的激发下产生橙红色荧光粗略定量：与分子量标准物对比；准确定量：荧光分光光度计，灵敏度达1-5ng/ml其它荧光染料：SYBRgold，灵敏度达20pg/ml；SYBRGreenI等适用浓度：大于0.25g/ml纯度鉴定：1.紫外分光光度法：原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异纯度鉴定：1.紫外分光光度法：原理：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异纯DNA：A260/A280=1.8，纯RNA：A260/A280=2.0；比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（270）比值升高：DNA变性、RNA污染混合污染：比值正常缓冲液的影响：在TE缓冲液和水、Tris等缓冲液中的比值有变化，应注意校正。核酸的紫外吸收特性220240260280300消光系数A260A280=1.6-1.8AGCTU核酸的最大吸收峰在=260nm蛋白质的最大吸收峰在=280nm酚的最大吸收峰在=270nm纯度鉴定1.紫外法：蛋白质和核酸紫外吸收特性的差异2.荧光光度法：原理：凝胶电泳观察图谱RNA电泳图谱：原核生物5S、16S、23S三条带；真核生物：5S和5.8S、18S、28S三条带；DNA分子大，迁移率小完整性鉴定：1.凝胶电泳法：根据电泳条带的数目、位置和形状判定RNA分子可以通过荧光强度积分来判定有无降解。2.其它方法：逆转录法、核酸杂交、芯片检测等。SampleWell25ng1kbladder0.8%Agarose124681012kbAgaroseGelElectrophoresisSybergoldDetectionLimit:~0.2-0.5ngDNAEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNAResultsofSouthernBlotControlTissueCancerTissueBRCA3EcoRIEcoRI核酸的保存：1.DNA的保存：-70C，TE缓冲液中数年，加入氯仿可防止污染原理：2.RNA的保存：-70C，醋酸钠溶液或焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液中，较长期保存。第二节基因组DNA的分离与纯化基因组DNA的特点：1.分子大，容易断裂2.容易污染其它来源的DNA分离纯化方法：1.酚抽提法2.甲酰胺解聚法3.玻棒缠绕法4.异丙醇沉淀法基因组DNA分离纯化技术路线生物体组织细胞裂解酚抽提法玻棒缠绕法甲酰胺解聚法DNA粗制品电泳分离特定DNA片段盐析法沉淀有机溶剂抽提法乙醇沉淀洗涤基因组DNA纯品凝胶中特定DNA片段酚抽提法tissueSDSProtKPhenolChloroETOHpptSpinDNA样品的纯化：1.分子大，容易断裂2.容易污染其它来源的DNA纯化方法：1.透析2.层析3.选择性沉淀4.凝胶电泳AgaroseGelElectrophoresis_+3片段回收回收方法：1.DEAE纤维素膜插片电泳2.转膜电泳法、透析袋电泳法3.凝胶洗脱法4.冷冻挤压法5.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法6.回收试剂盒：以硅为基础+片段回收（一）细菌的培养1.菌种的选择:大肠埃希菌2.培养基的选择:L-B培养基3.筛选标记的确定:抗生素4.生长状态的确定:对数生长期，测定OD600达0.4-0.6之间第三节质粒DNA的提取与纯一、概况（二）细菌的收获和裂解1.细菌的收获：离心，小量制备用1-1.2ml，大量制备用100-150ml2.细菌的裂解：可以用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。●大质粒(大于15kb)：容易受损，故应采用温和裂解法。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。●小质粒：在加入EDTA后，有时也加入溶菌酶，让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。(三)质粒DNA的纯化原理：质粒DNA相对较小；共价闭合环状方法：用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心：(每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子)。缺点：昂贵又费时替代方法：离子交换层析、凝胶过滤层析度的质粒。另外，现在已可买到现成的纯化KIT。二、质粒DNA的小量制备基本步骤：1.细菌的收获和裂解收获2.碱裂解法3.煮沸裂解4.质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策质粒ＤＮＡ的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解１．收获１）将2ml含相应抗生素的Ｌ-Ｂ加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。２）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。３）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。１）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris-HCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。一、碱裂解法２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。３）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/Ｌ乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，置于冰上３－５分钟。４）用微量离心机于4℃12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。５）加等量酚：氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000g离心２分钟，将上清转移到另一管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。６）用２倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置２分钟。７）用微量离心机于4℃以12000g离心５分钟。８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。９）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。i.此法制备的高拷贝数质粒（如Ｘf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg。ii．如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μlDNA溶液加到另一含８μl水的微量离心管内，加1μl10×限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温育1－2小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：１）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。STET0.1mol/LNaCL10mmol/LTris.Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)5%TritonX-100２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/LTris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。二、煮沸裂解３）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。４）用微量离心机于室温以12000g离心10分种。５）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。６）在上清中加入40μl5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。７）用微量离心机于4℃以12000g离心5分种，回收核酸沉淀。８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。９）加1ml70％乙醇，于4℃以12000g离心２分钟。10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。两个问题：１）质粒DNA不能被限制酶所切割：因酚：氯仿残留，可用离心柱层析注纯化DNA。质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策２）无质粒DNA的现象：核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。第四节RNA的分离与纯化RNA的特点：1.分子小，种类多，变化大2.容易受RNase降解分离纯化方法：1.异硫氰酸胍-酚氯仿一步法2.单相裂解试剂法3.硫氰酸胍-CsCl超速离心法4.盐酸胍有机溶剂法该方法适用于：１.培养的单层哺乳动物细胞２.悬浮培养的哺乳动物细胞３.易于分散成单个细胞的哺乳动物组织不适用于：不适用于从固体组织中提取RNA．因为用在SDS存在的条件下用蛋白酶K消化组织速度很慢，导致内源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制剂灭活前有时间发挥作用。异硫氰酸胍法用异硫氰酸胍和有机溶剂提取ＲＮＡ收集细胞，离心5000r/min，5分钟，弃上清，加入异硫氰酸胍变性沉淀蛋白和DNA.（异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠25mmol/L，Sarkosy10.5%,β-巯基乙醇0.1mol/L）有机溶剂：醋酸钠，水