核酸及理化性质

•核酸是存在于细胞中的一类大分子酸性物质，包括核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）两大类。•RNA和DNA都是以单核苷酸为基本单位所组成的多核苷酸长链。•RNA主要参与遗传信息的表达，而DNA则是遗传信息的载体。第一节核酸的种类、分布与功能一、核酸的种类与分布（一）核酸的种类（RNA、DNA）核糖核酸（ribonucleicacid-RNA）:转移RNA(transferRNA-tRNA)、信使RNA(messengerRNA-mRNA)、核糖体RNA（ribosomalRNA-rRNA）小分子细胞核RNA（snRNA）、染色质RNA（chRNA）、反义RNA（antisenseRNA）、双链RNA（dsRNA）、细胞质小RNA（scRNA）、具有催化活性的RNA（ribozyme）、各种病毒RNA。功能：三者共同参与遗传信息的表达。脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid-DNA），是遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。真核生物原核生物DNA细胞核（95%）线粒体、叶绿体（5%）核质区（拟核）RNA细胞质（75%）线粒体、叶绿体（15%）细胞核（10%）细胞质（二）核酸的分布二、核酸的生物学功能1928年，英国科学家Griffith发现肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒性是由细胞表面中的多糖所决定的。1944年，O.T.Avery（美）肺炎链球菌的转化实验,首次证明DNA是细菌遗传性状的转化因子。十年后证明DNA是遗传物质SRS+RS菌体的DNA+RS1952年，美国冷泉港Hershey-Chase噬菌体浸染细菌的实验。•DNA的基本功能是作为遗传信息的载体，为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板。•DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因（gene）。一个生物体的全部DNA序列称为基因组（genome）。基因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1×103bp，大肠杆菌为5.7×106bp，人为3×109bp。（一）DNA生物学功能（二）RNA生物学功能RNA的功能：1.参与蛋白质的合成rRNA(75-80%)tRNA(10-15%)mRNA(2-5%)2.遗传物质（病毒）3.具有生物催化剂功能第二节：核酸的化学组成一、核酸的元素组成基本元素：CHONP核酸的元素组成有两个特点：1.一般不含S。2.P含量较多，并且恒定（9%-10%）。因此，实验室中用定磷法进行核酸的定量分析。（DNA9.9%、RNA9.5%）二核酸的分子组成•核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。•核苷酸本身由核苷和磷酸组成。•而核苷则由戊糖和碱基形成所以，核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基NucleotidesLinkedbyPhosphodiesterBondOHPO42-PhosphodiesterbondO-P=O-OO5’3’PO42-OH3’5’PRPRPRPRPRPR123’5’123456Akindofphospho-polysaccharidesJuangRH(2004)BCbasicsTheNotationforNucleicAcidsPRB3’2’5’1’ATCGATCGPOH5’3’5’pApTpCpGpApTpCpG-OH3’5’pATCGATCG-OH3’ATCGATCGTheTwoChainsofDNAAreAntiparallel5’pCpGpApTpCpGpApT-OH3’5’pApTpCpGpApTpCpG-OH3’5’3’3’5’（1）参与DNA、RNA的合成、蛋白质的合成、糖与磷脂的合成。（2）在能量转化中起重要作用，ATP是生物体内能量的通用货币。（3）是构成多种辅酶的成分：NAD、NADP、FAD、FMN和CoA。（4）参与细胞中的代谢与调节（cAMP、cGMP）。3．核苷酸的生物学作用一、核酸的一般物理性质•DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇、氯仿从溶液中沉淀核酸）•DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。DNA核蛋白RNA核蛋白0.14mol/LNaCl-+1-2mol/LNaCl+-第三节核酸的重要理化性质DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。二、核酸的两性性质及等电点与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性基团（碱基），因而核酸也具有两性性质。•由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的pH值即为核酸的等电点pI）•DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。核酸在其等电点时溶解度最小。•RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。三、核酸的水解1.核酸的酸解和碱解•核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断（降解）。•酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间不同而不同。嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来。•DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别。在0.3-1mol/LNaOH溶液中，在室温至370C条件下RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响，若加温至1000C，4个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH的羟基参与作用有很大的关系。（在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。）2、核酸的酶解•生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。•以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）•以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）•根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。•核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；•核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。（小球菌核酸酶即可外切又可内切）•在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。四、核酸的紫外吸收•在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。五．核酸的变性、复性与杂交•核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。•能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。1、DNA的变性•在理化因素作用下，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为DNA的变性。•引起DNA变性的因素主要有：①高温，②强酸强碱，③有机溶剂等。▲实质破坏DNA的空间结构DNA的变性•DNA变性后的性质改变：①增色效应：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象；②旋光性下降；③粘度降低；浮力密度增大；分子量不变；④生物学功能丧失或改变。•2.RNA变性•RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。•利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。因为天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA变性后，约增加1.1%。3.DNA的热变性和解链温度（Tm）•用加热的方法使DNA变性叫做热变性。•DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将DNA的变性达到50%时，即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温度（meltingtemperature,Tm）,Tm也称熔解温度或DNA的熔点。一般DNA的Tm值在70-85C之间•DNA的变性温度：加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（融解温度，Tm）。•Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。DNA两股之间的吸引力不同：CG之间有3个氢键，而AT之间2个。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44DNA变性4、核酸的复性•变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。•将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。•复性反应的速度用Cot1/2表示。Co为变性DNA复性时的浓度，t为时间，以秒表示。DNA的复性定义恢复到天然双螺旋结构的现象复性的条件Ⅰ.足够高的盐浓度Ⅱ.适当的温度Ⅲ.恰当的复性时间DNA复性5、核酸的杂交（hybridization）•杂交的基础是DNA的复性。•热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。•这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。•核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。•两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。•核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。•不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。核酸的分子杂交核酸的杂交HybridizationofNucleicAcidsRNADNA1DNA2ProbeSouthernhybridizationNorthernhybridizationProbe:SmallDNAsegment•利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。•常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交核酸杂交的应用•Southernblotting(Southern印迹)•Northernblotting(Northern印迹)•Westernblotting(Western印迹)在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。6.探针技术•将已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。•探针技术属于Southern杂交的技术范畴。HybridizationofNucleicAcidsRNADNA1DNA2ProbeSouthernhybridizationNorthernhybridizationJuangRH(2004)BCbasicsPreparationofTraditionalNucleicAcidProbeAminoacidsequenceGLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-----GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC---Nucleicaci