大肠杆菌紫外诱变实验

大肠杆菌紫外诱变实验【实验目的】初步掌握诱变方案的设计和紫外诱变的实验手段。理解自发突变和紫外诱变的机理，分析不同诱变目的、诱变手段和诱变筛选在诱变应用中的关系。了解诱变育种在微生物工业中的作用。【实验原理】微生物菌种质量优劣对发酵工业具有至关重要的作用，由于自然界中的菌种一般在生产上都有不同程度的缺陷，而且自然突变频率低，突变幅度小，单纯依靠自然界中微生物群体来进行的自然选择有很大的局限性，往往不能满足实际生产的需要。因此现在的微生物发酵生产菌种绝大多数都是经过人工改造的，而菌种改造有诱变改造和基因改造两方面。虽然现在基因工程菌已经成为越来越重要的菌种改造方式，但通过物理化学诱变对菌种品质进行改造仍然是工业生产菌重要的来源。诱变分为物理诱变和化学诱变。物理诱变采用紫外光、X射线、射线、射线、射线、快中子和超声波等，其中紫外光诱变因其效果好、实验设备简单等优点而成为应用最广泛的物理诱变剂。而化学诱变则是采用一些可以和DNA起作用，改变其分子结构，最终引起遗传改变的化学物质对诱变对象进行处理，得到诱变菌种的方法。实验室中常用的有亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝酸胍等（这3种诱变剂诱变效果依次增加，毒性也依次增大）。物理诱变往往被分为电离辐射和非电离辐射，常用的电离辐射有X射线、射线、射线、快中子等。电离辐射的特点是穿透力强，对生物作用分为直接作用和间接作用。辐射的直接作用是指辐射所产生的直接物理损伤，是由于能量量子直接与染色体作用而造成的原始损伤，是一种物理作用；而辐射的间接作用则是一种化学作用，是由于生物细胞中的水分子受到辐射作用产生各种自由基，这些自由基和溶质分子或直接和染色体发生作用产生遗传损伤。由于不同作用的时效差别，辐射的作用过程大体可分为物理、物理化学、化学和生物学效应等4个阶段，时效发生可以从10-12s到几年。辐射中常采用的剂量单位为伦琴（R）。一个伦琴相当于在00C及101325Pa（760mmHg）下，每立方厘米干燥空气中能产生个离子对的电离剂量。此外还有拉德（rad）、尔格（erg）、居里（Ci）等单位。其换算关系如下：1rad=100erg/g=10-次衰变/秒非电离辐射最典型的就是紫外线，其电磁波谱位置为40~390nm。而由于DNA分子的紫外吸收峰位于260nm。因而波长在200~300nm之间的紫外线被用于紫外诱变。紫外诱变时的剂量与所用紫外灯管的功率以及照射距离和照射时间相关，实验中往往采用改变照射时间来改变照射剂量。由于照射致死率在95%~99%的时候回复突变株出现率最高，因而实践中多用70%~80%的致死率进行诱变。化学诱变和物理诱变相比主要的差别是诱变的特异性强，往往专一作用于DNA分子的特定结构。化学诱变主要分为4大类：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂和其他类。由于不同的化学诱变剂性能差别很大，在使用前必须对影响其效果的温度、PH值、光照、溶剂等做清楚的分析，同时对其半衰期、毒性及防护也要充分了解，这样才能保证使用的有效性和人体安全性。化学诱变的剂量是由使用浓度和处理时间决定的，操作中可以根据需要选择高浓度短时间处理或是低浓度长时间处理。在诱变中制定好诱变方案是很重要的，诱变育种包括诱变和筛选两步。首先制定一个明确的筛选目标，因为诱变是不定向的，我们必须采用定向的筛选方法将我们所需要的菌株从原始菌和突变株中分离出来，同时还应考虑选出的菌种在生长速度、温度适应、产孢子等方面不能产生过多不适应生产的变化。在充分考虑了实验的工作量要求后结合本实验室的人力、物力和时间要求提出诱变和筛选方案。在筛选方法选择中要考虑到兼顾筛选色工作量和可信度。当筛选方法可信度高时，往往检测方法是比较繁琐的（尤其是涉及一些蛋白质或氨基酸含量变化的突变类型）。这时为了提高筛选工作量往往降低筛选的可信度，减少筛选的繁琐程度，而在复筛中进一步加以确定。根据筛选目的和实验室条件选用合适的诱变剂。筛选方案确定后，不要经常改变，保持工作的稳定性，这样有利于总结提高。本实验以大肠杆菌为材料，选择紫外线为诱变剂，进行诱变处理：筛选青霉素抗性菌，绘制致死曲线并计算诱变率。【实验用具及材料】1.菌种大肠杆菌（Escherchiacoli）2.实验试剂及培养基BP培养基（牛肉膏蛋白胨培养基），见附录I。青霉素BP培养基，见附录II。生理盐水，见附录III。3.其他用具培养皿、三角瓶、离心管、试管、吸管、取液器、台式离心机、水浴锅、紫外线照射箱等。【实验方法及步骤】1.菌体准备（1）细菌培养：接种E.coli到BP液体培养基（500mL三角瓶装100mL培养基），置370C、200r/min培养16-18h，这时摇瓶中的菌液密度为107-108个菌/mL。（2）收集菌体：将三角瓶中的菌液转入离心管中，4000r/min离心10min。离心后，倒去上清液，加入100mL无菌生理盐水溶液和玻璃珠将细菌沉淀打匀，待用（取用之前务必摇匀）。2.细菌计数（1）菌液稀释：取三角瓶中的菌液0.5mL，采用10倍稀释法，稀释到10-4-10-6。（2）平皿涂布：分取3个稀释度的菌液各0.1mL加入BP固体培养基平皿中，用无菌涂棒将菌液涂匀。每个稀释度涂布2个平皿。将平皿置于370C培养箱中。培养过夜。（3）细菌统计：对培养后的平皿进行活菌统计，依照附录IV中的统计原则进行统计，算出原菌液中的菌密度。3.自发突变取三角瓶中0.1mL菌液加入到含有青霉素的BP固体培养基平皿中，涂布3个平皿。依照步骤2）进行细菌培养和计数。1）诱变处理由于紫外诱变引起的DNA变化有光复活作用，因而在诱变实验中最好在红光下进行操作，操作后将涂布好的平皿用报纸包好后置于370C培养箱中培养，操作过程如下：（1）分别吸取三角瓶中菌液3mL于4个无菌培养皿内。将培养皿放在10-15W的紫外灯下：距离30cm左右。（2）在诱变前先打开紫外灯稳定15-30min（使紫外灯输出功率稳定后进行实验，使致死曲线更准确），将待处理的4培养皿连盖放在紫外灯下灭菌1min，将4个培养皿开盖后进行紫外照射，分别在15s、30s、1min和2min的时候将培养皿的盖子盖上，然后关上紫外灯（如果有条件，应将平皿放在磁力搅拌器上，在照射过程中对菌液进行搅拌，使菌液均匀便于紫外线的作用）。（3）分别对照射5s、30s、1min和2min的4个培养皿做菌液稀释计数。分别稀释到10-4、10-3、10-2和10-1进行2个稀释度的涂布，每个涂布2个培养皿，进行培养计数，结合步骤2进行致死曲线绘制（如果有条件，应该做“计数，应做3个稀释度3个重复样的计数）。（4）将照射后的4个培养皿中的菌液0.1mL分别加入到含有青霉素的BP固体培养基平皿中，涂布3个平皿。依照步骤2）进行细菌培养和计数。2）光复活实验操作基本同于步骤4）诱变处理，其中在操作（2）之后将平皿暴露在白光中30min，然后再进行操作（3）之后的操作。3）实验记录（1）原菌液计数见表1【作业及思考题】（1）紫外诱变中要求菌液深度不超过2mm，为什么？（2）自发突变和诱变在机理上有什么不同？（3）比较暗操作和光复活情况下的致死率和抗青霉素突变率的差别。