第2章 药物定量分析方法与分析方法的验证

第二章药物定量分析方法与分析方法的验证•物理常数药物的物理常数是检定药品质量的重要指标，它包括：熔点、馏程、相对密度、凝点、比旋度、折光率、黏度和吸收系数等。用黑体字列出小标题，构成法定标准，测定方法均收载于药典“附录”中。第一节常用物理常数测定法一、溶解度溶解度是药品的一种物理性质，药物的化学结构与溶剂的特性对溶解度具有很重要的关系。允许有一定的差异，无法定意义外观、嗅味溶解度1）定义：ChP(2000)规定：熔点系指一种物质由固体熔化成液体的温度，熔融同时分解的温度，或在熔化时自初熔至全熔的一段温度。二、熔点2）法定测定方法：毛细管测定法，分三法：第一法：测定易粉碎的固体药品第二法：测定不易粉碎的固体药品第三法：测定凡士林或其他类似物质初熔全熔3）影响熔点测定的主要因素a.传温液mp.在80℃以下的，用水mp.在80℃以上的，用硅油或液体石蜡b.毛细管中性硬质玻璃管，长：9cm内径：0.9~1.1mm壁厚：0.10~0.15mmc.升温速度1~1.5℃/min熔融同时分解2.5~3℃/mind.温度计0.5℃刻度，且经校正三、黏度液体对流动的阻抗能力牛顿液体流动时所需的切应力不随流速的改变而改变（纯溶液或低分子物质溶液）非牛顿液体流动时所需的切应力随流速的改变而改变（高聚物溶液、混悬液、乳剂和表面活性剂的溶液）四、比旋度比旋度具有光学异构体的药物有相同的物理性质和化学性质，但它们的旋光性能是不同的，一般分为左旋体、右旋体和消旋体，在有些药物中，两种光学异构体的药理作用相同，如氯喹、可待因，但有很多药物的生物活性并不同，如奎宁左旋体治疗疟疾，奎尼丁右旋体治疗心律不齐。20D五、折光率对于液体药品，特别是植物油，是一种具有重要意义的物理常数。risinsinnirtDn六、吸收系数吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度摩尔吸收系数溶液浓度液层厚度百分吸收系数溶液浓度液层厚度L/mol1cm1cm1ml/g%1%11cmE七、凝点液体凝结为固体时，在短时间内停留不变的最高温度八、相对密度20℃液体药物密度/水密度比重瓶法：供试品用量少，较常用韦氏比重秤法：仅用于易挥发液体九、馏程（液体）在标准压力下，由第5滴→剩3～4ml温度范围纯度高的药品馏程短纯度低的药品馏程长第二节药物定量分析方法容量分析法经典化学分析重量分析法现代仪器分析技术光谱分析法色谱分析法电化学分析法容量分析法（滴定分析法）酸碱滴定法氧化还原滴定法络合滴定法沉淀滴定法非水溶液滴定法光谱分析法紫外—可见分光光度法UV—Vis红外分光光度法IR原子吸收分光光度法AAS原子发射分光光度法AES荧光分析法色谱分析法柱色谱法（CPC）薄层色谱法（TLC）气相色谱法（GC）纸色谱法（PC）高效液相色谱法（HPLC）1、重量分析法原料2、容量分析法原料3、光谱法制剂UV法荧光法AAS法4、色谱法原料、制剂HPLCGCTLC5、其他方法第三节药物分析方法验证一、目的证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。二、用途（一）药品质量标准起草时，分析方法需经验证。（二）药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。三、需验证的分析项目1.鉴别试验；2.杂质定量或限度检查；3.原料或制剂中有效成分含量测定；4.制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；5.溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。验证内容有：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性四、验证内容（一）准确度（accuracy）准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。回收试验空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M数据要求规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。1.含量测定方法的准确度原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。中药分析的准确度一般用加样回收试验衡量。中药回收率一般要求在95～105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90～110%范围内。RSD一般在3%以内。2．杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。（二）精密度（precision）精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。偏差（d）：测量值与平均值之差标准（偏）差（SD或S）相对标准（偏）差（RSD），也称变异系数（CV）1.重复性在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。2.中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备3.重现性不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。（三）检测限（limitofdetection，LOD）检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。是限度试验参数，无需定量测定。常用%、ppm、ppb表示。1．非仪器分析目视法用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。2．信噪比法用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。3．数据要求应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。（四）定量限（1imitofquantitation，LOQ）指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。常用%、ppm、ppb表示。常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定。（五）专属性（specificity）指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。（六）线性在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。（七）范围指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。（八）耐用性指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。（九）应用1.鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求。2.杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求。杂质的定量测定除检测限外，其它都要求。3.含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求。（十）各种含量测定方法对效能指标的要求1.容量分析法：用原料药精制品(含量99.5％)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2％；进行回收率试验。回收率一般在99.7～100.3％之间。2.UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1％。制剂的测定，回收率一般应在98％～102％之间。线性：吸光度A一般在0.2～0.7，浓度点n＝5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应大于0.999(n＝5)，方程的截距应近于零。3.HPLC法：要求RSD2％，回收率98％～102％之间。线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为5～7，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零。专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除生物样品分析时，常用RSD表示精密度，并可细分为批内（或日内）精密度及批间（或日间）精密度。批内精密度：是同一次测定的精密度。所得RSD应争取达到5％以内，但不能超10％。批间精密度：是不同次测定的精密度。所得RSD应控制在15％以内。附录《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》规定一般RSD应小于15%，在LOQ附近RSD应小于20%。