全国流感监测技术指南(1)

全国流感监测技术指南要点解析山东省疾病预防控制中心病毒病所电话：[phone]E-mail:[e-mail]所有讲课PPT都将放在我们公共邮箱里：邮箱名：[e-mail]密码：crbfzs内容•监测目的•流感样病例监测•流感样病例暴发疫情监测一、监测目的•监测流感活动水平和流行动态；•及时发现流感病毒变异并做出预警；•为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。二、流感样病例监测监测对象和时间•监测对象：流感样病例，即发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。•监测时间：所有国家级流感样病例监测哨点医院和流感监测网络实验室均全年开展流感样病例监测。监测诊室的设置•城市综合医院在内科门诊、内科急诊、发热门诊和（或）儿内科门诊、儿内科急诊开展流感样病例的监测；内科门诊开展流感样病例监测的诊室应包括所有内科诊室和感染性疾病科。•注：包括监测哨点医院设置的发热门诊和感染性疾病科。•城市儿童医院在儿内科门诊、儿内科急诊和（或）发热门诊开展流感样病例的监测。•不能仅将发热门诊设为监测诊室•哨点医院监测诊室的医务人员，按照流感样病例的定义，每天按科室登记各年龄组的流感样病例数和门急诊病例就诊总数，由哨点医院主管科室每日收集、汇总后，于每周一将本院各监测诊室上周数据录入到“中国流感监测信息系统”。•各市疾控中心每周一15时之前对本辖区监测哨点医院报告的数据进行审核，并将数据汇总后传真至省疾控中心。•流感样病例数和门急诊病例就诊总数在每个监测诊室的产生来源必须一致。流感样病例的报告•北方省份每家哨点医院在4-9月份每月采集5-15份流感样病例标本，10月-次年3月每周采集10-15份流感样病例标本。应避免集中、突击采样。•采样对象：发病3天内的流感样病例。•标本采集种类包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子。标本采集后放入含3-4ml采样液的采样管中。流感样病例标本的采集•标本采集后在保证生物安全条件下在48h内运送至相应的流感监测网络实验室，保存温度为4℃以下；如未能48h内送至实验室的，应置-70℃或以下保存，并应保证采集的标本1周内送到对应的网络实验室。标本应避免反复冻融。•全国流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，48h内将“流感样病例标本原始登记送检表”录入到“中国流感监测信息系统”中。流感样病例标本运送•生物安全：BSL-2级及以上实验室•具备病毒分离能力的实验室：利用状态良好的MDCK细胞进行病毒分离。MDCK细胞病毒分离阳性再用鸡胚进行病毒分离。•不具备病毒分离能力的实验室：收到标本后1周内利用核酸检测方法进行流感病毒亚型鉴定。•检测结果在检测完成后48h内录入“中国流感监测信息系统”。流感样病例实验室检测核酸检测的及时性•目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。且MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，故MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。但目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK细胞分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。流感样病例实验室检测•标本处理：收到标本后，24小时内进行标本处理和病毒分离，将原始标本分为三份，一份接种MDCK细胞接种，一份鸡胚接种，一份-70℃或以下温度保存待复核；•标本集中、收获和鉴定：培养1次的阴性标本可不再进行盲传，对血凝滴度小于1:16的毒株，稀释后进行传代。流感样病例实验室检测•各网络实验室将分离到的所有符合上送标准的流感毒株，同时上送国家流感中心和省级疾病预防控制中心。标本采集到送至国家流感中心的时间不超过1个月。注：上送标准：HA≥1:16,血凝抑制试验分型，量不低于5.5毫升（国家3毫升，省疾控中心2.5毫升）•每个开展病毒分离的网络实验室向国家流感中心上送流感毒株数量每年不低于30株，流行季节每月不少于5株。省级参比中心评估方案要求•省（区、市）内2/3的网络实验室开展流感病毒分离工作；全省（区、市）连续2年每家开展流感病毒分离的网络实验室每年送国家流感中心的毒株不少于30株；全省（区、市）连续2年送国家流感中心的毒株复核一致率在90%以上。流感样病例实验室检测•毒株保存：液体毒株可在-70℃或以下温度保存3年，冻干保存毒株可在4℃及以下温度条件长期保存，各网络实验室对分离出病毒株的原始标本应在-70℃及以下温度保存至少6个月。•各网络实验室对HA阳性不能区分型别或亚型的毒株和阳性标本务必在48小时内送至国家流感中心。三、流感样病例暴发疫情监测暴发疫情定义•指一个地区或单位短时间出现异常增多的流感样病例。•报告标准：•（1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例。•（2）在某一社区内（如同一村庄或街道办事处）一周内出现流感样病例异常增多。•可根据本地疫情特点及防控工作需要，制定更为敏感的暴发疫情报告标准。我省流感监测方案（2012版）对流感样病例聚集疫情和暴发疫情报告要求：•⒈流感样病例聚集疫情监测•⑴学校、托幼机构在同一班级或集体单位同一部门一周内出现流感样病例5例以上（含5例），或同一宿舍超过3例以上（含3例），应立即报告属地县（市、区）疾病预防控制中心报告。县（市、区）疾病预防控制中心接到报告后，应立即赶赴现场进行疫情核实、开展流行病学调查，并采集标本。调查报告应尽快逐级上报给省疾病预防控制中心，采集标本应在24小时内送达流感监测网络实验室。•⑵学校、托幼机构在同一年级或集体单位一周内出现流感样病例10例以上（含10例）、30例以下（不含30例），应立即报告所在地县（市、区）疾病预防控制中心。县（市、区）疾病预防控制中心接到报告后立即报告市级疾控机构，并及时赶赴现场开展流行病学调查、采集标本。核实疫情后，2小时内进行网络直报，调查报告及时逐级上报省疾病预防控制中心，同时报告当地卫生行政部门和通报教育行政部门。采集标本应在24小时内送达流感监测网络实验室。在聚集性疫情调查处理的过程中，根据疫情进展情况，及时对首次报告、进程报告和结案报告进行网络直报。•⒉流感样病例暴发疫情监测•⑴流感样病例暴发是指一个地区或单位短时间出现异常增多的流感样病例：1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；在某一社区内（如同一村庄或街道办事处）一周内出现流感样病例异常增多。各疫情单位发现流感样病例聚集性病例或暴发疫情后，应在2小时内以电话或传真等方式向属地县级疾病预防控制机构（农村学校向当地乡镇卫生院防保组）报告。县级疾病预防控制机构或乡镇卫生院防保组及时核实疫情，如达到报告标准，应在2小时内进行网络直报。暴发疫情的发现与报告•（1）首例发病时间填写本次暴发疫情中第一例流感样病例的发病时间，末例发病时间填写本次暴发疫情中最后一例流感样病例的发病时间。•（2）暴发疫情事件中的确诊病例要与“疾病监测信息报告管理系统”中的病例个案进行关联，未在“疾病监测信息报告管理系统”报告的确诊病例要进行补报。•（3）承担检测工作的网络实验室，要在“中国流感监测信息系统”中录入标本的实验室检测结果。报告该起疫情的疾病预防控制机构负责将标本信息和“疾病监测信息报告管理系统”中病例个案进行关联。•（4）在暴发疫情调查处理的进程中，各级疾病预防控制机构要及时对《流感样病例暴发疫情报告表》首次报告并进行更新，并做好进程报告和结案报告。•采集发病3天内流感样病例的鼻、咽、咽鼻拭子标本，必要时可采集急性期（发病7天内）和恢复期（发病2-4周）双份血清标本。每一起暴发疫情至少采集10份咽、鼻拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应全部采样）。•不能明确病原的可增加采样批次和数量。•标本运输：4℃条件下，于24小时内运送至流感监测网络实验室。暴发疫情标本采集•所有网络实验室收到暴发疫情标本后，24h内利用核酸检测方法进行流感病毒亚型鉴定，检测结果在检测完成后24h内上报“中国流感监测信息系统”。•具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室：对核酸检测流感病毒阳性的标本进行病毒分离。每起暴发疫情至少对5份核酸检测阳性的标本开展病毒分离，如采集标本数或核酸检测阳性的标本数小于5份，则对全部标本均进行病毒分离。暴发疫情标本实验室检测•2011年4月1日至今，山东省共报告8起流感样病例聚集性疫情和暴发疫情，其中济南市报告2起，济宁市报告6起，共报告流感样病例病419例，6起发生在中小学，2起发生在村庄；经实验室检测，3起为B型流感，2起为甲型H3N2流感，2起为腺病毒感染，1起未确定性质。8起疫情共采集标本92份，对其中11份进行了病毒分离，1份H3N2阳性，对73份标本进行了核酸检测，27份B型阳性，11份H3N2阳性。四、流感样病例标本采集•标本种类临床标本鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物等血清标本病人的急性期和恢复期双份血清临床样本收集的注意事项•要做好自我保护，操作要细心，严防标本间交叉污染•采集禽流感疑似病人的标本，最好采集下呼吸道吸取物•采集标本要有一定力度•标本采集后应迅速至于冰上或者4℃以下保存，因为流感病毒对热很敏感临床标本处理•鼻、咽拭子：为带有聚丙烯纤维的拭子标本，应先将带有聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。•鼻咽抽取液：用干净灭菌的毛细吸管在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上清。上清液可直接接种或低温保存。•组织标本的处理：取肺组织标本放至平皿中，用灭菌生理盐水清洗肺组织2～3遍，研磨成组织悬液，配置成10％～20％的组织悬液，2000rpm离心10min，加入抗菌素，取上清直接接种。•如原始采样液中未加入抗菌素，应在标本接种前补加，庆大霉素终浓度为10mg/mL，青/链霉素（终浓度:青霉素G100U/mL,硫酸链霉素100μg/mL），混匀后置4℃过夜或作用2h后进行接种。•血清学标本注意事项•应采集急性期和恢复期的双份血清•采集空腹血标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧；将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本；在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一塑料袋密封；将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密封。所有容器必须有生物危险标识。五、实验室检测2020/2/2455样本采集鼻咽拭子双份血清快速诊断血凝抑制试验或中和试验分型鉴定病毒分离常采用鸡胚和MDCK细胞分离方法•流感病毒分离：生物安全二级实验室•禽流感病毒分离：生物安全三级实验室正常细胞病变细胞细胞分离流感病毒选择敏感MDCK细胞细胞70～90％成片鸡胚分离流感病毒9日龄SPF鸡胚季节型流感病毒尿囊腔和羊膜腔接种分离病毒人禽流感病毒尿囊腔分离病毒•流感病毒操作要求生物安全规程•禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床标本和已知标准病毒•禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本•动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存鉴定方法血清学方法红细胞凝集及凝集抑制试验其它方法核酸检测快速检测试剂盒•使用的试剂可靠无误•红细胞悬液浓度是否合适•处理后的血清有无残余非特异性凝集素•选用标准抗血清是否准确•读取HA试验的结果是否正确•4个血凝单位是否准确•红细胞阴性对照•待鉴定病毒确保没有被细菌污染•稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确•RT-PCR•Real-TimeRT-PCR•做好记录：试剂、仪器使用，培养、检测原始记录•做好质量控制：对照，比对谢谢！