crisper-cas 基因靶向技术

CRISPR技术CRISPR/Cas9System1987年，日本大阪大学（OsakaUniversity）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列，正是这个特有的序列以后被证明发挥了DNA的定向识别功能。2013以后，研究者们在包括《science》和《naturebiotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。CRISPR-Cas主要由两部分组成：识别切割Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶。CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统。CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。CRISPR担当细菌的防护罩•CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。•前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。•通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPRassociated)，缩写为Cas。•目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。•Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。CRISPR的工作原理•当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(PreRISPRRNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。如果改造成我们的目的基因，就可以定向的进行基因修饰•目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40%已测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。•其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。•在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。•Cas9含有RuvC和HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNaseIII核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。•CRISPR／Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(ProtospacerAdjacentMotif)的5‘-GG-N18-NGG-3’特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。•由于crRNA参与并且起到精确导向的作用，所以CRISPR／Cas9打靶系统也被称为RNA导向(RNAguided)打靶系统。LimitationsoftheCRISPRimethodFirst,therequirementforanNGGPAMsequenceforS.pyogenesCas9limitstheavailabilityoftargetsitesinthegenome.AndrecentstudieshavesuggestedthattheS.pyogenesCas9proteincouldpartiallyrecognizeanNAGPAM,whichmightincreaseboththenumberoftargeta-blegenomesitesandthatofpotentialoff-targetsites.Second,thetargetingspecificityisdeterminedonlybya14-nt-longregion(the12ntofthesgRNAandthe2ntofthePAM),whichmightconferoff-targeteffectsinorganismswithlargegenomes.Thetheoreticalsequencelengthforuniquetargetingwitha14-ntrecognitionsequenceis268Mb(414).ProgrammableRNArecognitionandcleavagebyCRISPR/Cas9.•一种用来编辑基因组中DNA指令的强大科学工具现在也可以应用于RNA。来自加州大学伯克利分校和劳伦斯伯克利国家实验室的一个研究人员小组，证实借助于一种方法可以编程CRISPR/Cas9蛋白复合物在序列特异性的靶位点识别并切割RNA。这一研究发现有可能改变RNA功能研究的模式，为检测、分析和操控RNA转录物铺平了道路。相关论文发表在9月28日的《Nature》杂志上。•论文核心：就像可以利用Cas9以一种序列特异性方式来切割或结合DNA一样，RCas9可以一种序列特异性方式切割或结合RNA。•Cas9之所以可能具有基因组编辑能力是因为PAM的存在，PAM标记出了切割的位点，并激活了Cas9酶的切割活性。在这项最新的研究中，Doudna、Mitchell和合作者们证实，以一种相似的方式PAMmers还可以促进对靶ssRNA的位点特异性内切核苷酸切割•尽管RNA干扰已被证实可用于操控某些生物体内的基因调控，我们仍抱着强烈的兴趣开发出了RCas9这一基于核酸的RNA识别系统。现在我们清楚了RCas9的RNA识别分子基础，就只需要设计并合成出一条匹配的导向RNA和互补PAMmer。”RNA-directedgeneeditingspecificallyeradicateslatentandpreventsnewHIV-1infection•美国坦普尔大学研究人员7月21日，他们利用基因组编辑技术，首次成功地把艾滋病病毒从培养的人类细胞中彻底清除。•PNAS杂志谢谢大家！