第二章 细胞培养的设施与基本条件(6课时)

第二章细胞培养的设施与基本条件山东师范大学生命科学学院杨桂文第一节概述1.什么是细胞培养?细胞培养是组织培养的一种形式，所谓组织培养（tissueculture）习惯上泛指所有的体外培养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。其本意是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术称为组织培养。体外培养的种类细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。有标准化的工作方法培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。2.细胞培养的工作方法第二节细胞培养的实验条件一、实验室规划核心部分：准备室、缓冲间、培养室消毒和实验前的准备两间房实验后污物处理和清洗1、准备室准备室是培养用具清洗、消毒和作实验准备的场所，一般建在通风和光线充足的地方（在向阳面）。①水槽两处：实验后的清洗及清洁液浸后的清洗。②盛清洁液的陶瓷缸或玻璃缸。③清洗后器皿的凉干架和贮存柜。④高温干燥消毒箱和高压蒸汽消毒锅。⑤消毒后器皿的凉干架和贮存柜。⑥重蒸水装置。⑦电炉⑧工作台⑨污物桶准备室内的常用设备2、缓冲间①培养箱②离心机③显微镜④更衣室保护操作室的无菌环境，避免空气对流。3、培养室•培养室的设计①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，③门一般用拉门，以防止空气流动。④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。•培养室内的无菌操作要点①紫外灯无人时就要打开；②进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩；③每周清洗消毒一次；④所用物品要以外科手术方式严格消毒；⑤室内台面要要保持洁净；⑥所用物品要一次性准备好；⑦瓶口要用酒精火焰消毒；⑧尽量减少出入。培养室最核心设备为超净工作台二、实验设备超净工作台水平送风方式垂直送风方式•使用超净工作台应注意的几点问题①超净工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。②新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。③每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。④净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。⑤一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器中的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔3~6个月进行一次。⑥每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使之始终保持洁净。CO2培养箱①一定浓度的CO2对细胞生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5%）。②一定浓度的CO2可维持培养液恒定的pH。适用于开放培养，培养箱封口后，可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养皿或多孔板培养时，则需要高湿度和高CO2含量的空气。③它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。④培养箱内装有紫外灯。⑤通过气体流量计可以调节CO2和空气的比例。⑥在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。可防止因CO2培养箱中湿度较高，易长霉菌。电热干燥箱用于烘干和干热消毒玻璃器皿。消毒时，由于温度高达160℃，因此一般不要随意打开箱门，以免玻璃器皿突然遇到冷空气而破裂。要等温度降低到50℃以下时，才能打开箱门。蒸汽消毒器冰箱超低温冰箱家用冰箱离心机真空泵纯水设备滤器液氮容器显微镜天平加样器三、验室器械和器皿常用的手术器械有：解剖刀、白内障刀、解剖剪、眼科剪、镊子、蚊镊、持针器、止血钳等。各种金属器械使用后，要及时刷洗干净，再用洒精棉球擦拭晾干，以防生锈。金属器械①培养瓶②玻璃瓶③培养皿④吸管⑤抽滤瓶⑥消毒筒⑦匀浆器玻璃器皿其它杂品①洒精灯，②煮沸锅，③铝饭盒，④胶塞，⑤胶帽。第三节清洗与消毒一、清洗1玻璃器皿的清洗浸泡→刷洗→浸酸→冲洗新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、砷等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。浸泡用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次数太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。会严重破坏玻璃器皿的光洁度。特别注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。刷洗将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。浸酸（1）清洁液配方配方成分弱酸次强液强液重铬酸钾（g）清水（ml）浓硫酸（ml）硫酸浓度（v/v）501000908%100100016014%6020080080%①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。②先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。③缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险(绝不可将重铬酸钾倒入浓硫酸中)。④清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。•清洁液的使用注意事项（2）矽酸钠洗液贮存液(×100)矽酸纳80克加偏磷酸钠9克加热溶在1000ml水中。使用时用水稀释100倍，将器皿放入煮沸20min，冷却后冲洗，再用2%HCl浸泡2h后，自来水冲洗。矽酸钠洗液较清洁液安全，但价格较贵。先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min；瓶皿需每瓶灌满、倒掉，反复10次以上。然后再经蒸馏水漂洗3次,不留死角。晾干或烘干备用。冲洗自来水充分浸泡冲洗2%Na0H浸泡过夜自来水冲洗2%~5%盐酸浸泡30min自来水冲洗蒸馏水漂洗3次晾干灭菌2塑料器皿清洗3胶塞等橡胶类处理新购置者先经自来水冲洗→2%NaOH煮沸15min→自来水冲洗→2%~5%HCl煮沸15min→自来水冲洗5次以上→蒸馏水冲洗5次以上→蒸馏水煮沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞等。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经101.3kPa高压灭菌。4金属器械的清洗新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。使用前以蒸馏水煮沸10min，或包装好以101.3kPa高压15min。5除菌滤器的处理用过的滤器将滤膜去除，用三蒸水充分洗净残余液体，置干燥箱中烘干备用。二、包装包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。三、消毒灭菌1干热灭菌适于用玻璃器皿的消毒，160~170℃，90~120min或180℃45~60min。优点：使用简便，消毒后的物品干燥，易于保存。缺点：干热传导较慢，需较长时间。2蒸气灭菌用于玻璃制品、滤器、橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品的有效灭菌压力和时间不同，如：培养液、橡胶制品、塑料器皿等[68kPa(115℃),10min]；布类、玻璃制品、金属器械等[103kPa(121℃),15min]。优点：消毒效果好，时间短。缺点：需专人监管，不能离开人，应随时注意压力的变化。以免发生意外（手提式灭菌器）。3滤过除菌此法适用于消毒大多数细胞培养用液，如培养液、消化液、Hanks液、血清以及其他不能用高压蒸汽消毒的液体。用孔径0.22微米微孔滤膜可除去细菌和霉菌等。过滤除菌装置4紫外线适用于无菌室、超净工作台的消毒。紫外线的波长为200~300nm，最强是在254nm，6~15平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m以下，湿度45%~60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。优点：消毒效果好，面种大，使用方便。缺点：产生臭氧、气味难闻。5熏蒸消毒适用于无菌室等房间的消毒。高锰酸钾5~7.5g，加甲醛（40%）10~15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24小时，致少4小时以上。6煮沸消毒金属器械和胶塞在水中煮20~30分钟，趁热倾去水分即可使用。紧急情况时使用。7化学消毒化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制品进行消毒灭菌的方法。实验室地面、桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。2%煤酚皂溶液（来苏尔）0.25%新洁尔灭1%升汞3~5%甲醛溶液75%酒精。第四节培养用液和培养基细胞培养中除必需有培养基外，还用到各种各样的液体，包括水、平衡盐溶、消化液、缓冲液等。在组织培养中对这些液体都有一定的要求。一、水组织培养用的各种液体都是用水来配制，因此对水的质量要求很高，如水中含有杂质，会对细胞有不利影响，有些有毒特质和元素，即使含量极微，也可能引起细胞中毒以致死亡。因此组织培养用水需经过高度纯化。二、平衡盐溶液（BSS）平衡盐溶液（BSS）主要是由无机盐和葡萄糖组成，是细胞培养中常用的基本培养液体，可以维持渗透压、调节pH值以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。主要作为合成培养基（液）的基础液及用于洗涤组织、细胞等。平衡盐溶液的主要成分①无机盐：无机盐不仅是细胞生命所需成分，而且在维持渗透压，缓冲和调节溶液的酸碱度方面起重要作用。②葡萄糖：供给能量用。③酚红：酸碱度变化的指示剂。酸：黄色；中：桃红；碱：紫红色。平衡盐溶液的作用①作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压。②提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内。③提供细胞正常代谢所需的能量、水分和无机离子。④用来冲洗组织和细胞。⑤配制各种培养液的基础溶液。常用的几种平衡盐溶液Hanks液A．10母液配制法甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂NaCl80gKCl4gMgSO47H2O2gCaCl21.4g（2H2O者1.85g）待完全溶解后，补足三蒸水至500ml。乙液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂Na2HPO40.6g（12H2O者1.52g）KH2PO40.6g葡萄糖10g0.4%酚红50ml待完全溶解后，补足三蒸水至500ml。B．Hanks使用液的配制取上述甲、乙液等量用三蒸水稀释10倍，即成使用液。用前高压灭菌。Earle液一般认为Earle液比Hanks液缓冲能力强，但Earle液在不用橡皮塞的容器中需加CO2平衡（利用5%CO2气体平衡），其配法如下：A．甲液（10）配法NaCl68.0gKCl4.0gMgSO47H2O2.0gNaH2PO4H2O1.4g葡萄糖10.0g三蒸水800ml酚红（0.4%）100mlB．乙液（10）配法CaCl22.0g三蒸水100ml将甲液和乙液经67.6kPa高压灭菌15min、冷却后，将乙液徐徐倒入甲液中，分装，置4℃保存（称Earle贮存液）。C．使用液的配制取一份贮存液加9份三蒸水稀释后，塞紧瓶塞，写明标记，经67.6kPa高压灭菌15min，置室温或4℃保存备用。临用时，用7.5%NaHCO3调至所需pH。PBS液可配成含0.85%NaCl，pH7.2的PBS（简称pH7.2PBS）A．PBS贮存液的配法（