荧光定量简易操作流程

AppliedBiosystemsQuantStudio3&5实时荧光定量PCR仪V1.X相对定量简易操作流程相对定量简易操作流程1、双击桌面图标开启QuantStudioDesign&AnalysisSoftware，或从开始菜单AllProgramsAppliedBiosystemsQuantStudioDesign&AnalysisSoftwareQuantStudioDesign&AnalysisSoftware开启软件。2、进入主界面后，点击“CreateNewExperiment”。3、在“Properties”界面设置实验属性：a.输入实验的名称；b.选择仪器型号；c.选择仪器的block（加热模块）类型；d.选择实验类型：“ComparativeCT(∆∆CT)”；e.选择实验试剂类型：Taqman探针法选择“Taqmanreagents”，SYBR染料法选择“SYBRGreenReagents”，其他选择“Other”；f.选择运行模式（runmode）：普通试剂选择“Standard”；快速试剂选择“Fast”。相对定量简易操作流程4、点击“Next”进入“Method”界面，设置实验的运行程序：相对定量简易操作流程4.1、（可选）设置多梯度反应温度：○1单击（AdvancedSettings）；○2勾选veriflex，○3然后更改block上相应的反应温度，相邻区域温度差异不能超过5℃。注：QuantStudio3可设置3个梯度反应温度；上图为QuantStudio5示例图，可设置6个梯度反应温度。相对定量简易操作流程4.2、（可选）设置暂停程序：点击○1图标，○2勾选Pause，○3设置暂停前的反应循环数（Pauseaftercycles），以及暂停后的温度（PausingTemperature，范围：4~30℃）。相对定量简易操作流程5、点击“Next”进入“Define”界面，○1设置待测基因名称（Target）；○2设置样品名称（Sample）；○3设置对照样本和内参基因。5.1、在“Targets”内点击“Add”，添加待测基因。在“TargetName”中编辑基因名称；“Reporter”和“Quencher”中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。对于“Quencher”的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团则选择“None”。相对定量简易操作流程5.2、在“Samples”下点击“Add”，添加待测样品。在“SampleName”中编辑样品名称。5.3、在AnalysisSettings里设置对照样本和内参基因：点击下拉菜单选择合适的“ReferenceSample”（对照样品）和“EndogenousControl”（内参基因）。6、点击“Next”进入“Assign”界面，编辑反应样品板：6.1、利用鼠标单选或拖拽以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在“Task”选项中指定该反应孔的类型（U代表未知样本，N代表阴性对照）。相对定量简易操作流程7、点击“Next”进入“Run”界面，点击“Save”保存文件，然后点击“STARTRUN”开始运行。8、实验运行结束后，进入“Results”界面，点击右上角的“Analyze”按钮分析数据并查看结果。相对定量简易操作流程8.1、更改扩增曲线显示方式：单击（ShowPlotSetting），在“GraphType”中可更改扩增曲线的显示方式（log或linear图）。8.2、设置基线和阈值线：软件默认使用“Auto”功能自动设定基线和阈值线。8.2.1、查看阈值线或基线：单击（ShowPlotSetting），选择需要查看的基因，将show前的“Threshold”及“Baseline”选择打勾。扩增曲线图上会出现相应的基线范围和阈值线。相对定量简易操作流程8.2.2、手动设置基线和阈值线：去掉“Auto”的勾选，然后输入阈值，或用鼠标拖动阈值线和基线进行手动调节。相对定量简易操作流程8.3、选择“GeneExpression”查看基因表达柱状图。8.4、对于SYBRGreen实验，可以选择“MeltCurveplot”，查看熔解曲线。8.5、查看质控报告（QCSummary）结果：反应孔可能存在异常情况时，会出现黄色三角提示，数字1代表有一种情况，2代表有两种情况，以此类推。详细信息及解决方案可以在“FlagDetails”中查看。相对定量简易操作流程9、数据导出：在“Export”界面下根据需要导出数据。相对定量简易操作流程