DNA提取常见问题 check

DNA提取和常见问题分析及对策主讲人：关锰DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。DNA简单介绍DNA提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法CTAB法SDS法其它一、染色体DNA的提取质粒DNA的提取线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法•碱裂解法•煮沸法二、非染色体DNA的提取DNA提取的几种方法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤异丙醇沉淀DNA溶液CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。CTAB中各个组分的作用PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。CTAB提取缓冲液的改进配方氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理除蛋白质：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。除多糖：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合除酚类物质：除盐离子：70％的乙醇洗涤TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解TE中成分的作用称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃)CTAB及β-巯基乙醇保温1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4℃/-20℃保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干用TE溶解DNA,然后低温保存材料准备：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。液氮研磨：研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。细胞裂解：材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。高温温浴时，定时轻柔振荡。应注意的问题DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀，且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去。DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。应注意的问题基因组DNA的检测高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象DNA浓度及纯度的检测A260=1约50μg/mL双链DNA，A260/280约为1.8DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子4.有RNA的存留原因对策•重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质•重新沉淀DNA，让酒精充分挥发•增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）•加入RNase降解RNADNA提取常见问题问题二：DNA降解。1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融原因对策1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌5.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少。1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.吸附或沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失原因对策1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.植物要匀浆研磨充分3.增加吸附的时间，或低温沉淀4.小心操作