电化学_生物传感器快速检测大肠杆菌的研究进展.

0引言水和食品中细菌的检测,特别是致病性细菌的检测,对于控制传染病、保护环境卫生和人民群众身体健康都有着重要的意义。在水和食品中传播的各种致病性细菌中,大肠杆菌是最为普遍的一种。它是人及各种动物肠道中的常居菌,常随粪便从人及动物体内排出,广泛散播于自然界。人体感染了部分大肠杆菌可引起腹膜炎、出血性肠炎、胆囊炎、阑尾炎和尿道炎等疾病,严重者甚至死亡[1~2]。在卫生质量的评价和控制中,通常采用大肠杆菌作为指示菌,利用对指示菌的检测和控制来了解水体或食品等的受污染状况,从而评价其质量以保证卫生安全。大肠杆菌的传统检测方法包括多管发酵法和滤膜法等,存在操作繁琐、检测时间长(一般需要1~2天才能得到结果等缺点,难以满足污染源快速诊断的需要。近年来,许多基于不同检测原理的方法已得到长足的发展,比如聚合酶链反应[3~5]、免疫学检测[6~7]、质谱测定[8]、光学测定[9~10]等等。与传统方法相比,这些方法具有一定的优势,但所需的检测时间仍然较长。因此,建电化学/生物传感器快速检测大肠杆菌的研究进展程欲晓,金利通*(华东师范大学化学系,上海200062摘要:大肠杆菌广泛分布于自然界中,通常被用来作为水体系统排泄物污染情况的指示菌。它是大面积食物中毒的主要原因之一,严重感染者会引发败血症、肾功能衰竭等危及生命的并发症。电化学/生物传感器具有独特的优势,如能在浑浊溶液中操作、选择性好、灵敏度高、检测速度快等,因此在临床检测、环境保护和食品安全等领域得到了广泛应用。该文主要对电化学/生物传感器快速检测大肠杆菌的研究进展进行了简要的综述。关键词:大肠杆菌;电化学/生物传感器;快速检测DevelopmentofrapiddetectionofescherichiacolibyelectrochemicalsensorandbiosensorChengYu-xiao,JinLi-tong*(DepartmentofChemistry,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200062,ChinaAbstract:Escherichiacoli(E.coli,spreadingabroadinnaturalenvironment,arecommonlyusedasindicatorsoffecalcontaminationinwaterenvironments.Theyareoneofthemajorcausesoffood-borneoutbreaksandcanpro-ducelife-threateningcomplicationsrangingfromblooddiarrheatorenalfailure.Electrochemicalsensorsandbiosensorshavemoreadvantagesthanothermethodsinthattheycanoperateinturbidmediaandhavegoodselec-tivityandhighsensitivity.Therefore,theyareappliedwidelyinclinicdiagnostics,environmentalprotectionandfoodsanitation.ThispaperreviewsbrieflytherecentdevelopmentofrapiddetectionofE.colibyelectrochemicalsensorsandbiosensors.Keywords:escherichiacoli;electrochemicalsensorandbiosensors;rapiddetection基金项目:上海市科委No.06dz05824资助项目*通讯联系人,E-mail:[e-mail].29,No.1Mar.2009化学传感器CHEMICALSENSORS第29卷第1期2009年3月立快速检测大肠杆菌的新方法成为环境监测和食品卫生领域专家和学者的一个巨大挑战。电化学/生物传感器由于其独特的优势,如能在浑浊溶液中操作、选择性好、灵敏度高等,在各类传感器中占着重要的地位。其所测的信号通常是电位、电流、电阻等的变化,可以直接测量,便于仪器自动化、小型化和智能化。近年来,应用各种电化学/生物传感器快速检测大肠杆菌的方法纷纷发展起来[7,11~12]。1大肠杆菌及其生物学特性大肠埃希氏菌简称大肠杆菌,分类于肠杆菌科、埃希氏菌属,革兰氏染色阴性直杆菌,因德国的细菌学家TheodorEscherich在1885年首次分离出来而得名[13]。大肠杆菌是两端钝圆的短杆菌(如图1,长约2.0~3.0μm,宽约0.5μm,有时近似球菌。大部分大肠杆菌通常没有致病性,但是部分能产生肠毒素,导致人体肠胃炎等疾病[14]。特别是O157型的大肠杆菌会引起腹泻、出血性大肠炎和溶血尿毒症等疾病。当它入侵到肠道外的其它组织器官时,会引起尿道炎、膀胱炎、阑尾炎等,对于免疫力下降的病人还可引起败血症。大肠杆菌的致病物质包括侵袭力、内毒素和肠毒素,侵袭力则包含有K抗原和定居因子。K抗原具有抗吞噬、抵抗抗体和补体的作用。定居因子也称粘附素,目前已证实致泻大肠杆菌的定居因子是一种特殊菌毛。含有内毒素的大肠杆菌的细胞壁内具有内毒素活性,脂多糖层的脂类A是其毒性部位。大肠杆菌的肠毒素是某些大肠杆菌在生长繁殖过程中释放出来的外毒素,这些菌株称为产毒性大肠杆菌。大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌,常随粪便从人和动物体内排出,广泛传播于自然界,所以环境中一旦检出有大肠杆菌的存在,则意味着直接或间接地被粪便污染了;并且由于大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近,它的出现也可能预示着某些肠道病原菌(如沙门氏菌和志贺氏菌等的存在。因此,从19世纪末大肠杆菌被发现时,就开始被广泛用作饮用水、牛奶或食品等的粪源性污染卫生学指标,在环境学上也被广泛用作各种水体的细菌学指标[15]。2电化学/生物传感器检测大肠杆菌的进展2.1电流型化学/生物传感器检测大肠杆菌电流法(又称安培法是电化学传感器最常采用的一种检测方法。它的检测原理是当工作电极的电位设定在一定值时,被测物直接或者间接的在电极表面产生电流,从而可以定量分析被测物。大肠杆菌本身在电极表面不能直接进行电子传递。因此,需要氧化还原介质,根据氧化还原介质产生的电流大小与大肠杆菌的浓度成一定的关系,间接地检测大肠杆菌。该文课题组制备了新型纳米二氧化锡电极,用该电极作为工作电极,采用计时电流法对水体中大肠杆菌进行了快速计数研究[16]。由于水分子在纳米二氧化锡电极表面电解产生的·OH能够引起大肠杆菌细胞膜脂质过氧化,从而在电极上产生氧化电流,根据氧化电流变化与大肠杆菌数量的关系,实现了对大肠杆菌快速检测,检测限可达1×103cfu/mL。此外,通过大肠杆菌脂质过氧化后丙二醛含量的检测,对大肠杆菌在纳米二氧化锡电极上的电化学响应机理进行了初步的探讨。该文课题组制备铋纳米修饰电极,用于流动注射法快速安培检测大肠杆菌[17]。在培养过程中大肠杆菌产生葡萄糖醛酸酶,该酶与底物反应后产生4-硝基酚。铋纳米修饰电极对4-硝基酚具有较高的灵敏度,产生的电流响应与细菌的浓度成正比,从而实现了大肠杆菌的快速检测。大肠杆菌浓度在1.5×102~1×106cfu/mL与电流响应图1大肠杆菌的透射电镜图Fig.1TEMimageofE.coli化学传感器29卷4成正比,检测限达100cfu/mL,总分析时间为3h。该文课题组还制备了多种化学/生物传感器,并基于检测半乳糖苷酶的活性来快速检测水体中的大肠菌群[18~21]。例如,课题组基于Fe3O4磁性纳米颗粒-碳纳米管复合材料构筑了一种新型的酪氨酸酶生物传感器,并将其应用于大肠菌群的快速检测[20]。细菌产生的半乳糖苷酶与底物苯基-β-D-吡喃半乳糖苷反应产生苯酚,然后,采用酪氨酸酶生物传感器快速检测苯酚。大肠杆菌的浓度在2×101~1×105cfu/mL范围内与电流响应呈良好的线性关系,其检测限可达10cfu/mL。2.2电化学阻抗谱化学/生物传感器电化学阻抗谱是一种研究导电材料以及界面性质的有效手段,已经被广泛应用于电化学传感器的开发。对于一个阻抗特性的传感器,其电容、电感和电阻特性的组合会产生一个特定的阻抗信号;如果传感器周围环境发生变化引起上述特性的任何变化,都会造成阻抗的改变,将得到一系列新的阻抗特性,这就是基于电化学阻抗技术的传感器的研究基础。电化学阻抗生物传感器用于细菌的快速检测具有较好的选择性,而且与其它的电化学方法相比,这种方法不需要标志物,简化了传感器的制备。Li领导的工作小组在电化学阻抗技术检测大肠杆菌方面已取得很多优秀的成果[22~25]。如他们制备了无标志物的叉指微电极阻抗传感器用于检测大肠杆菌O157[22],细菌吸附于ITO微电极表面,从而导致了电极阻抗发生变化,大肠杆菌的浓度在4.36×105到4.36×108cfu/mL范围内与阻抗的变化值成正比。此外,他们把金叉指电极固定于微流动装置里,采用纳米磁珠分离牛肉中的大肠杆菌,将分离出的细菌溶液注入微流动装置里,通过检测电极交流阻抗的变化来测定大肠杆菌的浓度,能在35min内检测出160cfu/mL大肠杆菌[23]。该文课题组在金电极表面组装了巯基乙酸,通过碳二亚酰胺法把大肠杆菌抗体固定在金电极表面,从而制备一种新型的电化学阻抗免疫传感器[26]。把Fe(CN63-/Fe(CN64-作为氧化还原探针,考察了大肠杆菌特异性吸附到该免疫传感器引起的阻抗变化值,实现了对大肠杆菌的快速检测。并把该生物传感器应用于河水样品的检测,最低能检测出50cfu/mL的大肠杆菌。电化学阻抗生物传感器具有容易制备、成本低、易于封装和快速等特点,因此在食品的微生物检测中具有良好的前景。尽管如此,阻抗传感器的检测限与传统方法相比仍比较高,而且及样品的分析系统还不够完善,因此需要大量的工作使这种技术更加成熟。2.3DNA电化学生物传感器应用于大肠杆菌的检测近年来,各种灵敏的DNA或RNA电化学生物传感器已广泛应用于环境中细菌、病毒和各种化学物质的检测[27~31]。DNA生物传感器设计的依据就是核酸杂交动力学,因此确切来说它该是核酸杂交生物传感器的简称。DNA电化学生物传感器是DNA生物传感器中的一种,是由固定了单链DNA(ssDNA的电极和电化学活性识别元素构成。为了提高杂交的专一性,ssDNA片段长度范围一般从十几个碱基到几十个碱基,通常采用人工合成的短的寡聚脱氧核苷酸,其碱基序列与样品中的靶序列互补。首先将ssDNA片段固定到电极表面,在适当的温度、pH值和离子强度条件下,固定在电极上的ssDNA与杂交缓冲溶液中的靶基因发生选择性杂交反应。如果样品中的DNA片段出现不互补的碱基,在电极表面就不能形成双链杂交分子(dsDNA;如果样品中含有完全互补DNA片段,则在电极表面形成dsDNA,从而导致电极表面结构的变化,然后通过检测电极表面的电活性识别元素的电信号,达到识别和测定靶基因的目的。每个种属生物体内都含有其独特的核酸序列,因此检测核酸关键是设计一段寡核苷酸探针,探针一般由10~30个碱基对组成,是一段单链核酸分子,能够专一地与特定靶序列进行杂交[32],从而检测出特定的生物种属。杂交过程具有很高的特异性和敏感性,这是核酸检测研究的基础,也是设计DNA生物传感器首要和基本的条件。把DNA电化学生物传感器应用于大肠杆菌的检测已有很多文献报道[33~35]。Baeumner等[33]制备DNA生物传感器能在15~20min内快速、灵敏地检测DNA的浓度;通过检测大肠杆菌提取和纯化后的DNA浓度,对水体中大肠杆菌的浓度进行定量检测,检测限可达40cfu/mL。Arora等[35]程欲晓等:电化学/生物传感器快速检测大肠杆菌的研究进展1期5制备了生物亲和素聚苯胺修饰铂电极,并且把带有生物素的DNA探针通过亲和素-生物素系统的作用力固定于聚苯胺修饰电极上。首先将大肠杆