鸭乙肝实时荧光PCR检测方法的建立

2010年7月7日DHBV组合1指导老师：肖福英组员：聂惠蓉（组长）梁冬妮、卢玉芬、许祖贤2010年7月7日DHBV组合2EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirus[Abstract][contents][Material][Procedure][ResultandDiscuss][DHBV]realtimequantitativePCR2010年7月7日DHBV组合3EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusSectionheader[Abstract]Objective:Establishingareal-timequantitativePCRmethod,detectthecontentofduckHBVquicklyandaccurately2010年7月7日DHBV组合4EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusSectionheader[Abstract]Methods:AmplifiedDNAfragmentsofduckhepatitisBvirusbyPCR,afterthatfragmentsisconnectedtothepUCm-TvectorandthentransformedintoE.coliDH5αtoobtaintherecombinantplasmidstandards,designingreal-timefluorescentPCRprobes,primers,optimizingsystemforrenderingReal-timequantitativePCRstandardcurve.2010年7月7日DHBV组合5EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusSectionheader[Abstract]Results:InthisstudyweobtainpUCm-Teasy-DHBVplasmidstandardwiththeconcentrationof117.9μg/mlanddrewthestandardcurve,thereforeweestablishareal-timefluorescencequantitativePCRmethoddetectingtheduckhepatitisBvirus.2010年7月7日DHBV组合6EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusSectionheader[Abstract]Conclusion:WithReal-timefluorescencequantitativePCRdetectingDNAcopynumberrapidlyandaccurately,soitcanbeusedfordetectionofserumduckhepatitisBvirus;absolutequantificationofstandardconstructionandstandardcurveestablishedmakeanobjectiveevaluationforthefurtherstudyoftheefficacyofclinicaltreatmentofhepatitisBdrugs.2010年7月7日DHBV组合7EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractProcedureResultandDiscuss[Material][Material]一、实验动物血清二、主要仪器高压灭菌锅、冰箱、离心机、普通PCR仪、电泳仪、成像系统、荧光PCR仪三、实验试剂一管式PCR试剂盒、TaqDNA聚合酶、胶回收试剂盒、DNAMarkerK、HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶、连接酶、感受态细胞（大肠杆菌DH5α）2010年7月7日DHBV组合8EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterial[Procedure]ResultandDiscuss[Procedure]PCR引物及探针的设计鸭乙肝病毒DNA片段的获取PCR产物的胶回收纯化2010年7月7日DHBV组合9EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterial[Procedure]ResultandDiscuss[Procedure]PCR产物同T载体的连接反应DHBV重组质粒载体转化E.colDH5α转化E.colDH5α菌的扩大培养和筛选2010年7月7日DHBV组合10EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterial[Procedure]ResultandDiscuss[Procedure]DHBV阳性菌的质粒提取纯化及OD值的测定序列测定TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线构建2010年7月7日DHBV组合11EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]一、鸭乙肝病毒阳性血清PCR扩增结果DHBV基因扩增直接采用煮沸过的血清作为模板，使用上游引物1和下游引物1这对引物进行扩增，产物大小为262bp，在1.5％琼脂糖凝胶中跑电泳，结果如图1所示。PCR产物的加样孔中的条带较清晰，在200bp-300bp之间，初步判断为目的条带。图1桂林麻鸭乙肝病毒DNA经PCR扩增的电泳图数字1-9泳道为DHBV基因使用上游引物1和下游引物1扩增的结果，M为Marker泳道2010年7月7日DHBV组合12EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]二、DHBV的PCR产物的胶回收纯化图2DHBV的PCR产物胶回收前电泳图3DHBV的PCR产物回收后电泳图2010年7月7日DHBV组合13EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]三、转化DH5α菌的筛选结果图4DHBV重组质粒转化DH5α菌后PCR筛选电泳结果把扩大培养摇好的菌液作为模板直接进行PCR筛选，对应的9瓶菌产物大小为188bp。扩增后的电泳结果如图4所示，加样孔中均出现了预期的目的条带，说明没有假阳性，连接并且转化成功。2010年7月7日DHBV组合14EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]四、直接进行质粒测序经过NCBIBlastseq2软件对重组质粒的序列与DHBV特异性片段序列进行两两比对，说明目的片段成功连接入载体。五、实时荧光定量PCR标准曲线的构建1.动力学曲线2010年7月7日DHBV组合15EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]2.标准曲线2010年7月7日DHBV组合16EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]3.读标准曲线标准曲线的斜率为-3.346，扩增效率Eff=99.0%，且各模板拷贝对数与Ct值之间呈现良好的相关性（R2=0.992），符合曲线的三个参数标准，故可信度较高，系统生成的回归方程为：Ct=-3.346C+39.73。2010年7月7日DHBV组合17EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]4.本实验优点⑴实时荧光定量PCR方法的检测，具有敏感性高、特异性强、重复性好、自动化程度高、无污染等优点，适合用于生物学研究领域。目前对DHBV的检测,国内外多采用同位素32P标记的斑点杂交法、竞争性PCR技术和多重PCR检测血清等，但均存在着一定的弊端。例如斑点杂交法,该方法虽特异性强,但灵敏度较差,易造成放射性污染,同位素半衰期短,用同位素标记的探针不能长期存放。而由于TaqMan系统及荧光探针的应用，它对DNA的检测显得比其他法要方便、快速、准确得多。2010年7月7日DHBV组合18EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]⑵自从Mason于1980年从家养的北京鸭体内发现了鸭乙型肝炎病毒后，由于其自然宿主分布广泛、经济便宜、容易饲养，所以感染DHBV鸭的动物模型，近十几年来已越来越多地被用于探讨HBV发病机理及筛选抗肝炎病毒药物的研究。2010年7月7日DHBV组合19EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]⑶本实验采用基因克隆技术成功构建出用于鸭乙肝病毒核酸定量的高纯度、高稳定性以及低成本的质粒DNA标准品，并成功建立了标准曲线，为进一步的研究药物对鸭乙肝病毒的作用提供了必要的技术平台，同时为国内鸭乙肝病毒核酸定量试剂盒的研发起到了一定的推动作用，具有一定的市场价值。2010年7月7日DHBV组合20EstablisharealtimequantitativePCRmethoddetectingDuckhepatitisBvirusAbstractMaterialProcedure[ResultandDiscuss][ResultandDiscuss]5.本实验存在的缺点⑴实验所涉及的PCR体系条件及温度程序是根据文献提供，结合实验经验摸索出来的，没有经过一个大量的条件摸索过程。⑵绘制标准曲线过程，标准品的荧光动力曲线不是相当的标准，基线期可以看出本地信号很高。从平台区可以看出，