第3章 氨基酸

第3章氨基酸氨基酸－蛋白质的构件分子（一）蛋白质的水解氨基酸蛋白质肽加酸、加碱、加酶氨基酸是蛋白质的基本组成单位根据水解程度完全水解氨基酸混合物不完全水解大小不等的肽和氨基酸蛋白质的基本结构单位──氨基酸一、氨基酸的结构通式二、二十种常见的蛋白质氨基酸分类、结构及三字符号三、氨基酸的性质四、氨基酸混合物的分析分离一、α－氨基酸的一般结构①与羧基相邻的α-碳原子上都有一个氨基，所以称为α-氨基酸（脯氨酸除外）。②只有连在α-碳原子上的R基团是可变的，即各种氨基酸的区别就在于R基的不同。•除R为H(即Gly)外，其余氨基酸的α-碳原子都为不对称碳原子（具有旋光性）。•α-碳原子上带有酸性的羧基和一个碱性的氨基，在一定条件下都可解离，是两性电离。氨基酸结构通式二、氨基酸的分类蛋白质氨基酸：蛋白质中常见的20种氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：不参与蛋白质组成，在生物体内呈游离或结合态的氨基酸。二、氨基酸的分类根据侧链基团的结构将20中常见氨基酸分为3大类脂肪族氨基酸中性氨基酸（一氨基一羧基氨基酸)（5种）含羟基氨基酸(2种)含硫氨基酸（2种）酸性氨基酸及其酰胺（4种）碱性氨基酸（二氨基一羧基氨基酸）（2种）芳香族氨基酸:Phe，Tyr，Trp杂环族氨基酸:His，Pro甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）缬氨酸（Val,V）亮氨酸（Leu,L）异亮氨酸（Ile,I）中性氨基酸异亮氨酸含有两个手性碳丝氨酸（Ser,S）苏氨酸（Thr,T）含有羟基的两个氨基酸，苏氨酸含有2个手性碳原子含羟基氨基酸半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）含硫氨基酸体内代谢甲基的供体酸性氨基酸及其酰胺碱性氨基酸芳香族氨基酸His经常参与酶的活性中心的构成,它是唯一一个R基(咪唑基)的pKa值在7附近的AA.杂环族氨基酸吡咯环咪唑基根据R-基团的极性，将氨基酸分为两类：极性氨基酸：根据pH7时是否带电非极性氨基酸：极性不带电荷：Ser,Thr,Tyr,Asn,Gln,Cys,Gly（7种）极性带正电荷:Lys,Arg,His(3种)极性带负电荷：Asp,Glu（2种）Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,Met,Pro（8个）据营养学分类必需ＡＡ非必需ＡＡ据氨基、羧基数分类一氨基一羧基ＡＡ一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThrArg、His非极性氨基酸极性不带电荷按理说应是极性氨基酸带正电荷的R基氨基酸带负电荷的R基氨基酸三、氨基酸的性质两性解离和等电点重要化学反应光学性质氨基酸的兼性离子形式兼性离子：是指在同一个氨基酸分子上同时带有能解离出质子的-NH3+正离子和能接受质子的-COO-负离子，使同一氨基酸分子带有正、负两种电荷的离子形式。R-CH-COOHNH2R-CH-COO-NH3+氨基酸的解离依照Bronsted-Lowry的酸碱质子理论，氨基酸在水中的两性离子既起酸（质子供体）的作用，又起碱（质子受体）的作用。H-CH-COO-NH3+H-CH-COO-NH2+H+H-CH-COO-NH3++H+H-CH-COOHNH3+作为质子供体作为质子受体在适当的酸碱度时，氨基酸的氨基和羧基的解离度完全相等。此时，[正离子]=[负离子]，净电荷为零，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，成为两性离子。这时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点，以pI符号表示。R-CH-COOHNH3+R-CH-COO-NH3+R-CH-COO-NH2-H+-H++H++H+正离子（+）pH等电点兼性离子pH=等电点负离子（-）pH等电点氨基酸的等电点求法：1.先写出解离方程式；2.找出中性分子状态；3.中性状态分子两边的解离常数的平均值即为pI。氨基酸的解离常数可用测定滴定曲线的实验方法求得以甘氨酸（Gly）为例氨基酸各基团的表观解离常数见表3-3.根据平衡常数公式可得：pH=pKa+lg[质子受体]/[质子供体]氨基酸的带电状况与溶液的pH有关。改变pH可以使氨基酸带上正电荷或负电荷，也可使处于兼性离子状态。知道了氨基酸的解离常数，pI怎么求？当氨基酸完全质子化时（即处于酸性溶液时），再用碱滴定k3H-CH-COOHNH3+H-CH-COO-NH3+H-CH-COO-NH2k1k2k4Ka1Ka2Gly+Gly±Gly-a1=Ka1[Gly±][H+][Gly±]Ka2[H+]整理得Ka1·Ka2=[H+]2两边取对数pKa1+pKa2=2pHpH=pKa1+pKa22=pI结论：氨基酸的等电点相当于该氨基酸的两性离子状态两侧基团pK值之和的一半。即pI＝1/2（pKa1+pKa2）侧链上有解离基团的氨基酸的pI如何计算？（1）首先氨基酸完全质子化；（2）写出其解离方程式：①先解离α-COOH,再解离侧链基团上的COOH;②再解离α-NH3+,最后解离侧链基团上的NH3+。（3）标出各解离步骤的pK值，最后以两性离子状态两侧基团pK值之和的一半计算其等电点。例如：（1）Glu的pK1(α-COOH)=2.19，pK2(γ-COOH)=4.25，pK3(α-NH3+)=9.67,计算其pI值。（2）Lys的pK1(α-COOH)=2.18,pK2(α-NH3+)=8.95，pK3(ε-NH3+)=10.53，计算其pI值。氨基酸等电点的计算pI=2pK´1+pK´2一氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´1+pK´R一氨基二羧基AA的等电点计算：pI=2pK´2+pK´R二氨基一羧基AA的等电点计算：可见，氨基酸的pI值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pK′值之和的二分之一。等电点的应用：1.氨基酸在等电点时溶解度最小。2.利用不同氨基酸等电点不同，可利用电泳的方式分离氨基酸。氨基酸的化学反应（一）由氨基参加的反应（二）由羧基参加的反应(自学)（三）由氨基和羧基共同参加的反应（四）由侧链R基团产生的反应(一)由氨基参加的反应1.与HNO2的反应2.酰基化和羟基化反应3.形成西佛碱反应(自学)4.脱氨基反应(自学)1.与HNO2的反应R-CH-COOH+HNO2NH2R-CH-COOH+N2+H2OOH这是VanSlyke氏氨基氮测定法的原理2.酰基化和羟基化反应氨基酸氨基的一个H可被酰基或烃基（包括环烃及其衍生物）取代，这些取代基对氨基酸的氨基有保护作用。R-CH-COOH+R′XNH2R-CH-COOH+HXNHR′R′=酰基或烃基X=卤素（Cl,F）（1）酰基化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂。酰化试剂：苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、对-甲苯磺酰氯、邻苯二甲酸酐★丹磺酰氯（DNS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。NGly—Ala—Ser—Leu—PheC→→DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—PheC水解DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-AA在紫外光激发后发黄色荧光。（2）烃基化反应常用于蛋白质的N端氨基酸分析A.与二硝基氟苯的反应B.氨基酸与苯异硫氰酸（PITH）的反应Sanger反应2.4一二硝基氟苯（DNFB）DNP-氨基酸，黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸Edman反应苯异硫氰酸酯，PITC苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸（三）由氨基和羧基共同参加的反应1.两性解离2.与茚三酮的反应3.形成肽键4.离子交换反应+3H20水合茚三酮(无色)NH3CO2RCHO+还原性茚三酮紫色化合物(弱酸)加热+2NH3+还原性茚三酮茚三酮在弱酸中与α-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨、脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质（λmax=570nm）。Pro、Hy-Pro与茚三酮直接形成黄色化合物（λmax=440nm）茚三酮3、成肽反应4.离子交换反应R-CH-COOHNH3+R-CH-COOHNH3M+MA++A+氨基酸（在酸性溶液中）阳离子交换剂氨基酸盐R-CH-COO-NH２R-CH-COOMNH2+MB-+B-氨基酸（在碱性溶液中）阴离子交换剂氨基酸盐分离氨基酸的柱层析法就是根据这个原理设计的。（四）侧链R基参加的反应(自学)用于蛋白质的化学修饰1.苯环（Phe和Tyr）2.酚基（Tyr）3.OH基（Ser,Thr）4.SH基及-S-S-键（Cys,Cys-CYs）5.吲哚基（Trp）6.胍基（Arg）7.咪唑基（His）光学性质1、旋光性：除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。2、紫外吸收光谱：参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示特征的吸收谱带，最大光吸收（max）分别为280、275、和257nm。由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。蛋白质在280nm有最大光吸收，可用分光光度法测定样品中蛋白质含量。四、氨基酸混合物的分析分离（一）基于电荷性质差异的分离方法。（二）基于分配系数（极性）差异的分离方法——分配层析。（三）气液层析（气相层析、气相色谱）。（四）高效液相层析（HPLC）。（一）基于电荷性质差异的分离方法1、电泳分离Glu、Leu、His、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向及相对速度：GluLeuHisLyspI3.225.987.599.742、离子交换柱层析P152磺酸型阳离子交换树脂氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于：1.氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力。2.氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用。（二）基于分配系数（极性）差异的分离方法——分配层析1、纸层析固定相：吸附水流动相：丁醇、醋酸、水分配系数在流动相中分配系数越大，移动越快。基本步骤：点样、展层、现色、定性（定量）