细胞实验操作基本流程

细胞实验操作基本流程（基于明确的细胞试验计划）1.实验物品准备1.1实验耗材准备书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。操作准备：物品清洗、干燥、打包灭菌、合理放置。1.2实验试剂准备书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。操作准备：选择合适的物品存放地点；使用前集中放置；需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好；需要无菌配制的试剂在无菌操作要求下配制。2.实验预约2.1操作预约：401室在预约本上登记；分析测试中心向屈老师交申请单后在预约本上登记。2.2细胞冻存复苏预约：每周定时开放液氮罐，由负责同学在群里通知。2.3细胞检测预约：填写申请单，向主管老师申请。3.细胞房环境检查3.1清洁消毒：操作前后有无清洁台面、地面，并行紫外线杀菌10-15分钟。3.2仪器设备：运行是否正常，有无灯光闪烁报警或标志警示，有无异常状况。3.3台面：是否洁净无污垢，有无多余物品放置，必要物品是否放置齐备。4.清洁准备4.1洗手：肥皂洗——5‰新洁尔灭泡手10秒——70%酒精喷手4.2台面物品放置：正中：酒精灯；左侧：吸管及其他耗材盒子；右侧：试管架、大镊子、酒精棉球瓶、打火机、移液器；左上方：试剂瓶；右上方：废液缸5.实验操作5.1基本操作：换液、传代、冻存、接板、复苏、细胞计数、细胞观察5.2垃圾处理：培养基、缓冲液等使用过的无害废液用废液缸装；固体垃圾丢入垃圾筐中6.实验善后6.1可回收实验耗材处理：吸管、试管、离心管等可反复使用的耗材按标准流程清洗。6.2不可回收实验废物处理6.2.1酸碱类废液分类倒入废液瓶存放，由学院通知处理6.2.2无害废液弃入水槽，大量流水冲洗6.2.3固体垃圾放入垃圾袋，丢入垃圾桶6.3种子细胞处理：实验过程中需要保种或实验完成后仍有未用完的种子细胞，按标准流程进行细胞冻存，以待后续使用。6.4实验试剂处理：未用完的试剂重新放回合适的存放地点；如试剂污染或变质，按实验废物处理。6.5报备：耗材、试剂如需补充，需要向老师申请批准购买；仪器设备如有损坏，需要告知负责同学或老师进行维修。7.清洁值周和安全检查7.1清洁值周：轮流进行，以导师分组，每日例行清洁和周二、周五大扫除，需要按要求进行清洁并在值周表上登记及拍照。7.2安全检查：清洁值周的同时需要每天巡视细胞房、准备间内的电器设备，有情况需要及时上报。注意事项：1、试验计划三原则：要做什么、为什么这么做、准备怎么做2、实验操作三原则：多看、多问、多想3、突发事件处理：及时向负责同学、老师汇报情况细胞操作相关仪器设备使用恒温干燥箱使用注意事项注意事项(一)干燥箱恒温干燥时恒温室下方的散热板上，不能放置物品，以免烤坏物品或引起燃烧。(二)放入箱内的物品不应过多、过挤。(三)严禁把易燃、易爆、易挥发的物品放入箱内，以免发生事故。(四)如果发现干燥箱箱门下方红灯报警必须尽快切断电源。(五)放置物品干燥时间不超过24小时。二氧化碳培养箱使用箱门应轻开轻闭，避免粗暴开关。取出细胞时应避免箱门长时间敞开，以免培养箱内环境不稳定，孵箱中的水盆应定期（每2周左右）更换无菌双蒸水，并擦洗水盆，紫外照射30分钟。二氧化碳气瓶更换先关闭总阀和分压阀，更换后先开总阀，再慢慢调整分压阀，指针总阀在5分钟左右，分压阀指针在0.15左右。超净台使用使用超净台工作15分钟前开紫外灯进行照射灭菌，在进入操作之前应关掉紫外灯，10分钟左右后进入。超净台上力求简洁，以利于保持无菌状态，每一步操作均应用酒精擦拭，不宜对着超净台说话。倒置相差显微镜使用分为3点：1.相差装置的调换与安装。卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可以吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。2.调焦。打开光源，旋转激光器装盘将“o”对准标示孔，使普通聚光器部分进进光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操纵方法进行对光和调焦。旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应。3.合铀调整。拔出目镜，插进合铀看远镜，一边从看远镜内内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动看远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将看远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合抽调整完毕，抽出看远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合抽调整。使用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香柏油。低速离心机使用将需要离心的样品对称放入离心机内，关好盖子，接上电源，调整转速和运转时间，按离心键。待转速降至0000后，打开盖子，取出样品。传递窗使用每扇门旁设面板一块，面板有一只LED显示灯，一只开门按钮和一只杀菌灯开关。显示灯为绿色时，为开门指示灯，灭表示对面的门卫开状态，禁止此门打开，按开门按钮无法打开门。亮表示允许开门，按开门按钮，门锁打开，开门传递物件。杀菌开关可以控制箱内的杀菌灯的亮和灭。酸缸、酸筒使用酸缸分为内缸和外缸，外缸里面放液体，内缸里面放要清洗的器皿，浸泡结束后，将内缸向上提出，内缸上面有很多的小孔，液体从内缸体小孔流出，取出物品，盖上盖子。移液器使用一、标准操作适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。1)按到第一档，垂直进入液面3-5毫米。2)缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少。3)打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。二、黏稠或易挥发液体的移取在移取黏稠或易挥发的液体时，很容易导致体积误差较大。为了提高移液准确性，建议采取以下方法：1)移液前先用液体预湿吸头内部，即反复吸打液体几次使吸头预湿，吸液或排出液体时最好多停留几秒。尤其对于移取体积大的液体(如1000~1)，建议将吸头预湿后再移取。2)采用反相移液法：吸液时按到第二档，慢慢松开控制按钮，打液时按到第二档，部分液体残留在吸头内。微量移液器使用使用方法同移液器的使用。细胞计数板使用分3点：将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。计数板四大格细胞总数，压线细胞只计算左侧和上方的。然后按照公式计算：细胞数/ml=四大格细胞总数/4*𝟏𝟎𝟒高压灭菌锅使用分为6点：1.首先将内层灭菌筒取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。2.放回灭菌筒，并装入待灭菌物品。3.加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌筒的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4.用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。5.灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，压力降为0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物体。6.将取出的灭菌培养基放入37℃恒温培养箱内培养24小时，经检验无杂菌生长，即可待用。酶标仪使用冰箱使用冰箱中试剂药品分类放置，关闭冰箱时检查是否关好。液氮罐使用使用前，检查容器内部是否清洁干燥，充液氮前要用少量液氮预冷。不能在容器盖上放置物体和密封颈口，放进或取出冷冻物品时，要尽量使罐口打开时间短，以减少液氮消耗，也不要把提桶完全提出来。严防冲击和碰撞。严谨用硬物清除颈管内的冻霜，以免损伤颈管。超低温冰箱使用1.一般制冷温度设置为-60度，过滤网每个月必须清洗一次。2.存取样品时门开得不要过大，存取时间尽量要短。3.注意经常要存取的样品放在上面两层，需要长期保存不经常存取的样品放在下面两层，保证开门时冷气不过度损耗。4.定期除霜。细胞实验基本液体配制培养基配制PBS配制成分配比为：1%（w/v）NaCl,0.025%KCl,0.144%𝐍𝐚𝟐𝐇𝐏𝐎𝟒,0.025%𝐊𝐇𝟐𝐏𝐎𝟒.调整pH为7.2，在高压蒸汽灭菌锅中121℃（15psi）处理15分钟后室温下保存冻存液配制90％血清、10％DMSO戊二醛固定液配制2.5%戊二醛（用PBS配置）多聚甲醛固定液配制2%多聚甲醛（用PBS配置）新洁尔灭洗手液配制0.1%新洁尔灭（蒸馏水配制）稀盐酸配制浓硫酸配制