1细胞培养技术

细胞培养技术药物科学与技术学院——周立军参考书目《细胞培养》，世界图书出版公司，1996年《培养细胞学与细胞培养技术》，上海科学技术出版社，2004年本次课内容细胞培养的基本知识一、绪论培养法的种类、培养法的发展、细胞培养的常用术语、培养细胞的作用及意义、培养法的应用二、培养细胞的特征培养细胞的生长方式和类型、培养细胞的生长特点和生长增殖过程、细胞培养的条件及影响因素一、绪论细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。即：从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。涉及有细胞生物学、生物化学与分子生物学、动物学与植物学、病原学、肿瘤学、遗传学、生物工程学甚至光学、物理学等等学科。因其涉及面很广所以已经渗透到生命科学的各个领域。细胞培养（cellculture)组织培养的概念组织培养（tissueculture）：其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。器官培养（Organculture）：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法，以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养（invitro）。培养法的种类体外培养细胞培养组织培养器官培养贴壁培养悬浮培养体外培养种类细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。群体培养（massculture）：即将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。克隆培养（cloneculture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。群体培养（左）和克隆培养（右）原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集落形成，细胞围绕中心漩涡状排列﹙×100﹚原代培养第7天，多个集落形成并融合﹙×100﹚培养法的发展组织培养法的发展经历近百年。德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的萌芽试验。1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细胞生活一个月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍能生存。培养法的发展关于神经轴突的结构和形成有争议。哈里森（生理学家）首先解剖了蛙胚的原始脊髓节段在淋巴液中进行培养。在显微镜下观察到从神经芽细胞延伸出神经轴突的状况。建立起一套合理的无菌培养技术——哈里森悬滴培养法哈里森悬滴培养法培养物凝固的淋巴凹玻片槽盖玻片•将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴的盖玻片上，•淋巴很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。•然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡封固。•蛙胚神经组织存活了数周——体外培养组织和细胞的基本模式系统。卡氏瓶的发明Carrel用反复传代的方法使细胞系存活34年。他采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶（卡氏瓶，Carrelflask）等都是对组织培养的重要贡献。特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。组织培养发展示意图1923年，Carrel设计了卡式瓶培养法，扩大了组织的生存空间。1924年Maximow的双盖片培养法，使之更易于传代和减少污染。1957年Dulbecco等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细胞系(cellline)的建立。近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，各国建立细胞库我国组织培养的发展20世纪30年代传入我国。20世纪50年代起步。20世纪70年代，成为医学和生物学研究中应用的手段。组织培养常用术语原代培养（primaryculture）：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。传代培养（passageculture）：将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。注：传代（passage，subculture）原代培养胎儿细胞培养比成人容易；成体组织中成纤维细胞、肾上皮细胞比较容易，上皮细胞培养难。细胞间的分离酶：胰蛋白酶、胶原酶、单一种类细胞的分离培养：根据培养条件——培养基、细胞接着面的条件、接着速度、离心法等。细胞系（cellline）：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。细胞株（cellstrain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。克隆（clone）：指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。有分化特性的细胞系和细胞株组织来源细胞系增殖性物种分化特性脾Friend永生小鼠合成血红蛋白Morris肝癌HTC永生大鼠酪氨酸转移酶诱导髓性白血病K562永生人合成血红蛋白垂体瘤GH2,GH3永生大鼠产生生长激素黑色素瘤B16永生小鼠产生色素髓性白血病HL60永生人合成球蛋白胶质瘤CCM永生人胶质纤维酸性蛋白成神经细胞瘤C1300永生大鼠生长轴突对细胞培养技术的评价优点：1、活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动；2、可控制：选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段）；调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）；利用方法：研究技术、记录方法；3、应用广：领域多：医学研究、生物技术、基因工程等对象广：各种动物（低等动物--高等动物--人类）一种动物（不同年龄、不同组织）正常或异常（肿瘤）4、较经济：可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象；缺点：1、培养细胞会发生改变；2、对人员、设备等要求较高。与体内主要不同相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。主要表现失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋向单一化。提示要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。对细胞培养技术的评价细胞培养技术的研究、观察内容细胞内活动：例如能量的代谢、DNA转录、凋亡及蛋白合成等。细胞内部与细胞外界之间的作用：如细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌等。细胞间的相互作用：如形态发生、细胞间的粘着作用、接触抑制、密度抑制等。细胞内的流动：如信号传导、钙离子的流动、RNA的移动、激素受体复合物的易位等。遗传学：如遗传分析、转染、转化等。细胞培养的应用领域（一）、在病毒学研究中的应用（二）、在免疫学研究中的应用（三）、在分子生物学研究中的应用（四）、在遗传学研究中的应用（五）、在药理学研究中的应用（六）、在毒理学研究中的应用（七）、在肿瘤学研究中的应用（八）、在器官移植中的应用病毒检验方法病毒培养全程5-30天细胞病变判定荧光染色：1.病毒涂片2.血清型专一抗体荧光染色中和试验：培养出的病毒与血清型专一性抗血清作用，再接种至细胞病毒培养：1.细胞培养2.接种至细胞检测病毒CPE正常细胞病变细胞杂交瘤技术Hybridomas免疫学脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Köhler和Milstein,19751984年Nobel医学奖培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡无限生长细胞分泌X抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c单克隆抗体制备免疫学在分子生物学研究中的应用1、体外培养细胞的转化2、DNA转导技术3、基因诊断和基因治疗器官移植→组织工程种子细胞（干细胞）支架材料组织工程二、培养细胞的基本特征培养细胞的生长方式和类型培养细胞的生长特点和生长增殖过程细胞培养的条件及影响因素（一）培养细胞的生长方式和类型粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。如：成纤维细胞、心肌与平滑肌细胞、表皮细胞、骨与软骨细胞、肿瘤细胞悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。如：血、脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞粘附型（贴壁型）细胞粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式细胞在体内、外的粘附方式存在差异体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征。体外：细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。体外培养下，形态异常可反映其胚层起源，按照培养细胞的形态，可分为几大类型：成纤维型细胞上皮型细胞游走型细胞多形型细胞成纤维型细胞上皮型细胞游走型细胞多形型细胞成纤维型细胞•来源：中胚层间充质组织起源的细胞，如：成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。•形态：类似体内成纤维细胞的形态，胞体呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2～3个长短不等的突起，中央有卵圆形核。•生长特点：排列成放射状，漩涡状生长。上皮型细胞•来源：起源于内、外胚层的细胞，如：皮肤及其衍生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性肿瘤等。•形态：类似体内的上皮细胞，呈扁平、不规则、多角形，中有圆形核。•生长特点：细胞紧密相连成单层膜相靠—紧密相连—成薄层—铺石状培养细胞的形态不稳定，可因各种因素而发生改变，如pH、细胞密度、污染等因素。HeLa细胞：血清高血清——成纤维样细胞低血清——上皮样细胞pH标准pH——上皮样细胞太酸或太碱——成纤维样细胞细胞密度低密度——成纤维样细胞高密度——上皮样细胞转化与否未转化——成纤维样细胞转化后——上皮样细胞悬浮型细胞概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长。来源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞为主。特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形，呈单个或小细胞团。优点：生存空间大，提供数量大传代方便(不需消化)易于收获可获得稳定状态缺点：观察不方便很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)培养细胞的生长特点粘附并伸展是大多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着，与支持物形成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁平或放射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型或其他类型生长。密度依赖性细胞接种密度过高或过低都会影响细胞的生长、增殖。当细胞粘附生长、融合成单层时，细胞变得较为拥挤，而扁平形状的程度减少，与培养基的接触面减少，同时，培养基中的营养物逐渐消耗，细胞分裂减弱，增殖减慢。二、培养细胞的生长增殖过程单个细胞的细胞周期（cellcycle）细胞系的生长过程培养细胞传代的生存期单个细胞的细胞周期（cellcycle）→MG1→S→G2间期DNA合成期︵前中后末︶有丝分裂期组织培养细胞生命期原代培养期传代期衰退期原代培养期又称初代培养期（primaryculture），从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1～4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形态相似。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。传代培养期初代培养期一经传代后便改称做细胞系cellline。此期为三期中最长，可维持二倍体核型（二倍体细胞系）。当传代30～50代后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。衰退期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。体外培养细胞一代增殖生长过程第3代BMSCs的分裂指数曲线02040608010012013579111315时间(d)分裂率（‰）接触抑制（contactinhibition）：贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相互接触后便停止了分裂增殖，不再进入S期，也不会出现交叉重叠生长。恶性细胞无接触抑制现象，所以可将其作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。密度抑制（densityinhibition）：培养液营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细胞分裂停止。培养细胞生长过程中的特点传代细胞可连续传7——10代，细胞形状基本相同，但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现为:细胞增殖速度明显减慢，胞浆中