WE 172 生化分析仪用户手册

WE172生化分析仪用户手册地址：上海军工路1300号(赛特工业园区)邮编：200433电话：[phone]WE172生化分析仪用户手册PX/WE172第2页共16页2生化分析的基本原理生化分析最常用的方法是通过对反应溶液进行比色分析来进行的，其分析的原理是根据郎伯-比耳(Lambert-Beer)定律，即：当一束平行单色光垂直通过吸收介质溶液时，由于溶液吸收光能量会导致光强度降低，溶液的吸光度与吸收物质的量浓度和液层厚度的乘积成正比。比耳定律只有在入射光是单色光的前提下才能成立。单色光是一个理论概念，实际中使用滤光片或光栅来使入射光线接近理论上的单色光。郎伯-比耳定律的数学表达式为：A=Log(I0/I)=K*C*L式中：A----吸光度I0----入射光强度I----出射光强度K----吸收系数C----吸收物质的量浓度L----液层厚度（光径）如果：公式中C以1.0mol/L为单位、L以1.0cm为单位，则k称为摩尔消光系数以ε表示，单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm)]，A=KCL可写成A=εC。在实际工作中，通常用mmol/L来表示浓度单位。ε值在入射光波长、溶液的性质等因素确定时是一个常数。如：NADH在260nm时ε260NADH=15.0×103在340nm时ε340NADH=6.22×103。在生化测定时，实际上每次测定都是进行一次化学反应。化学反应的过程可以通过图1概括的表示，是反应产物量和反应时间的关系．在图中虚线的左侧，随着反应时间的延长，反应产物不断增加。产物量随时间而异，因此为反应动态期；在图中虚线的右侧反应产物随反应时间延长，产量无明显变化，反应已趋向平衡，称为反应平衡期。WE172生化分析仪用户手册PX/WE172第3页共16页3图1:任何化学反应都朝着趋向平衡的方向发展，但反应速度各异．在某些反应中加入催化剂，将加快反应速度，缩短反应达到平衡所需的时间，也即缩短图1中虚线左侧的周期。但催化剂不会改变化学反应方向和达到平衡的状态。达到平衡时，反应产物量和催化剂存在与否无关。测定各种分析物原则上都有动态法和平衡法，不论在反应试剂中是否加入酶催化反应。终点法测定：反应达到平衡后再进行测定的，这类方法称为平衡法或称终点法。（图2）图2当样品和试剂混合后，反应就开始了，当被测物质在反应过程中应完全被转化或消耗掉（95%以上），即反应达到了终点，在相当的一段时间里溶液的吸光度是保持稳定的，等反应达到平衡后（即终点）便可以开始测定。而在到达反应终点前的时间称为孵育时间。终点法中较为常见的是浓度在测定范围内与吸光度成线性关系的一些项目，这些项目只需要通过单点标准品的定标校准就可以进行测试。WE172生化分析仪用户手册PX/WE172第4页共16页4结果的计算：终点标准法：样品的浓度＝样品管的吸光度×标准液浓度标准管的吸光度终点因数法：如果仪器、试剂等实验条件相对很稳定，可以减少定标的次数，其计算方法可参照以下方法。但为了保证测定的准确性，应进行日常的质量控制工作。实际是以上终点标准方法在计算方法上的一种变化样品的浓度＝样品管的吸光度×FF＝标准液浓度标准管的吸光度二点法（固定时间法）：固定时间法在自动分析仪中的应用，有助于我们解决反应的特异性问题，最明显的例子就是苦味酸法测肌酐。很多物质如维生素C、乙酰醋酸、葡萄糖、果糖以及某些药物也能和碱性的苦味酸溶液反应而形成红色的复合物，这些物质在此项分析中被称为假肌酐。这些干扰物质呈色反应较慢，如果只测定开始一分钟的反应，就可以避免假肌酐参与反应，明显提高了苦味酸法测肌酐的特异性。计算方法如下：样品的浓度＝△样品管的吸光度×标准液浓度△标准管的吸光度△样品管的吸光度＝样品管的第二次吸光度值－样品管的第一次吸光度值△标准管的吸光度＝标准管的第二次吸光度值－标准管的第一次吸光度值动态法测定(连续检测法)如果对某化学物的测定是在反应动态期中进行的，产物随反应时间不断变化，则这类方法总称为动态法。应该强调的是，所有测定酶活力的方法，由于测定的是样品中酶催化反应作用能力的大小，即从反应动态期变化来观察酶活力，因此这类反应只有用动态法检测。早期临床实验室测酶活性时常使用“终点法”（取样法）比色测定，先让样品与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后改变溶液的pH值使酶反应停止，再加入显色试剂反应呈色，测出底物和产物的变化。由于此法灵敏度较低，手工操作不易控制酶反应时间，引起误差较大。比较典型的反应是用“赖氏”法测定丙氨酸氨基转移酶。50年代后，Warburg首先用分光光度计。在340nm处直接监测到反应物NADH的动态变化过程。由于不停止酶反应，不需在反应中间添加其它呈色试剂，测定方法简单，结果准确，逐步取代了“取样法”成为目前测酶活力的主要方法。由于经历了一个发展过程，命名比较混乱而且大部分不甚确切，IFCC建议命名为“连续WE172生化分析仪用户手册PX/WE172第5页共16页5监测法”，不用目前广为流行的“动态法”。图17-7是一个典型酶反应过程。图17-7酶促反应中基质[S]、产物[P]和反应速率V在不同时间变化的模式图在酶作用下，底物[S]浓度不断下降，随之有相应产物[P]产生。不少酶在反应一开始的阶段，由于各种因素影响，反应速度较慢，称为延滞期，随后在过量浓度的底物存在条件下，酶反应以恒定的速度进行，不受底物浓度变化的影响，这段反应称为线性反应期或零级反应期。随时间延长，反应速度除与酶量有关，还与底物浓度有关。即v＝k(a－x)式中：a---原来底物浓度x---消耗的底物浓度如反应物浓度项上指数为1，称为一级反应，假如反应速率受二种或二种以上物质浓度的影响，则各个反应物浓度项上指数总和作为反应级数，可以分别为一级、二级或多级反应，总的将这段反应时期称为非线性反应期。在设计和选择测定酶活性浓度方法时必须是在“最适条件”下测定最大反应速度。即所测的最大反应速度应该是初速度即V0。理论上的V0在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一定量的底物，才能测出反应速度。由于不需停止酶反应。很容易得到整个酶反应曲线，然后根据反应曲线情况，避开延滞期和非线性反应期，只在线性反应期测定最大反应初速度。由于，自动生化分析仪的高精密度和高灵敏度，连续监测法能在很短时间内准确测定反应速度，从而求出准确的酶活力。WE172生化分析仪用户手册PX/WE172第6页共16页6直接连续监测法：这方法是在不停止酶反应条件下直接测反应体系中底物或产物的变化，从而计算出酶活性浓度，应用最广的有NAD(P)H反应系统，可以测定大部分的脱氢酶，比如丙氨酸氨基转移酶的测定；还有的是所谓“色素原”底物，其本身为无色或微黄色，在酶作用下生成有色化合物，适用于测定水解酶和一些转移酶，比较多的应用为碱性磷酸酶、淀粉酶等项目的测定。还有某些方法是设法在原来反应体系中添加一些试剂，这些试剂必须不与酶作用也不影响酶活性，同时又能与酶反应物迅速作用，产生可以被直接测定的物质，典型的例子是Ellman的胆碱酯酶测定法，底物为硫代乙酰胆碱，酶水解产物硫代胆碱与添加的二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用立刻生成黄色化合物，可在412nm用分光光度法连续监测。酶活性的浓度单位50年代以前酶活性浓度单位的命名混乱，常以方法提出者的姓氏来命名，例如淀粉酶的Somogyi单位，碱性磷酸酶的King单位等等，定义参差不齐，给临床医师带来很大不便，尤其在建立“连续监测法”测酶后，大量酶应用于临床，此混乱现象更为突出。1963年国际生化协会通过广泛讨论，提出一个国际单位定义来表示酶量的多少，即1分钟能转化1微摩尔底物（μmol/min）的酶量为一个国际单位，以IU表示之，由于意见不一致，至今尚未指定酶反应温度，而同一量的酶，在不同温度时间为1分钟所转化底物的量将有明显差异。为避免临床上误认为只要是同一国际单位的酶量在国际上无论何处所测结果都应一致，目前大多数实验工作者常省略国际二字（简写也由IU改为U）。通常最常使用的测定温度为37℃，以模拟人体内的酶活力情况。临床上测定的不是酶的绝对量而是浓度，1963年并未明确规定用ml或L表示体积。旧的文献中可见到mU/ml，或U/L。目前在临床化学中，几乎都习惯用U/L来表示体液中酶活性浓度。我国由于近年来大量使用生化分析仪的连续监测法测酶，已逐步不再使用各种古老单位，而使用U/L来表示酶活性浓度。近年来国际上大力推广SI制，我国已明确SI制为法定计量单位制，SI制中酶活性单位为Katal，即1秒中转化1个摩尔底物（mol/s）的酶量，Katal对体液中酶量而言显然过大，常用单位为ukatal或nkatal。上述国际单位和katal间关系如下：1U＝1μmol/min＝16.67nmol/s＝16.67nkatal在我国不论实验室还是临床医师对katal都不太熟悉，如报告使用katal/L报告酶结果时，最好同时注明相应的U/L。连续监测法中酶活性的计算连续监测法计算方便，不需作标准曲线或标准管，用生化分析仪监测酶反应过程时，很容易求出反应体系每分钟吸光度变化，由于被检测的物质均是在单色光条件下测定的单一物质。所以可根据摩尔消光系数可求出A△相当测定物质变化的摩尔数，摩尔消光系数由显色物质在特定的条件下的固有物理性能决定的。由于临床上需要知道的是标本中的酶的活力而不是反应体系中的，计算中要考虑标本的稀释倍数，计算公式为：WE172生化分析仪用户手册PX/WE172第7页共16页7酶活力(U/L)=△A/min×F反应总体积（ml）×1000F＝ε×样品体积（ml）×d此式中：1000为U/ml到U/L的转换系数ε为被测定物质在测定波长处的毫摩尔消光系数（L/mol·cm）A△为吸光度变化d为比色杯的光径（cm）应该指出的是，该计算是建立在被检测的物质是在单色光下测定的单一物质的条件上的，而实际上，仪器一般很难输出单色光，还有杂散光的存在，波峰值可能出现差异，通常得到的单色光准确度误差为中心波长±2nm、半波宽为8±2nm；另外，被测定物质的摩尔消光系数（ε）也会在外界条件影响下发生变化，比如溶液的pH值、反应的温度等等。所以，根据以上公式计算的F值和实际值可能会有偏差，建议用校准血清对仪器定期校准。另外，常数F值的大小对检测结果有较大的影响。此值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但线性窄。此问题与仪器测定的最小分辨率相关，分析仪吸光度读数最小分辨率一般都需控制在0.001，也就是仪器须保证对同一溶液反复进行测定时，吸光度误差控制在0.001以下，虽然此值不大，但已可使测定结果产生F值/1000的误差，如F值为6000，则每分钟测定吸光度如有0.001微小变化，结果将是出现上下6U/L的误差，对于一些参考值较低的酶，测定的重复性显然差了。F值的大小要考虑结果的精密度，还应考虑到测定时间的影响，在某些半自动生化分析仪测定时把读数时间缩短到30sec.，此时0.001的吸光度变化对于A△/min将是0.002。改变F值最方便方法是改变标本稀释度，稀释倍数愈小，F值愈小。应当注意试剂和样品的比例调节不是随意的，应当尽量按说明书推荐的比例要求。WE172生化分析仪用户手册PX/WE172第8页共16页8关于双波长测定的波长设定：λ1／λ2选择一般遵循以下原则：1．λ1取待测物吸收峰对应的波长，而取其吸收光谱曲线的“波谷”对应的波长为λ2。这样选择主、次波长间的光吸收值最大，检测灵敏度提高。2．λ1取待测物的吸收峰的波长，λ2取等吸收点对应的波长。等吸收点是系列不同浓度待测物的吸收光谱曲线有一交汇点，此点对应波长的A与浓度无关。3．反应中显色产物的吸收峰对应的波长为λ1，而试剂空白(显色剂)的吸收峰对应的波长为λ2。以丙氨酸氨基转移酶(ALT)为例：主波长为340nm，而副波长可以选择380、405、700nm。由于NADH在380nm处亦有吸光度(摩尔消光系数380nm：1.33×103)，所以在计算K值时要主波长(λ1)摩尔吸光度(6.