DNA的生物合成

目录DNA的生物合成(复制)DNABiosynthesis，Replication第九章目录中心法则（centraldogma）遗传信息传递方向的规律基因表达：是指将遗传信息由DNA转录为RNA、再翻译成蛋白质的过程目录目录复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA目录复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication第一节目录一、半保留复制的实验依据和意义DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。•半保留复制的概念AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA目录目录•密度梯度实验——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮N15-DNA的细菌培养于普通培养液第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果目录按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。•半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。目录二、双向复制原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制中的放射自显影图象目录Cairns复制模型—θ型复制目录目录A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC目录5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’目录（2）起始点和方向①原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的重复的保守顺序，可被酶识别。②方向：大多是双向、对称复制,也有单向或不对称的。③速度：原核生物复制叉移动快(约105bp/min);真核生物复制叉移动慢(约5×102～5×103bp/min)目录复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）目录三、复制的半不连续性3535解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)目录•顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(前导链）。•另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链（后随链、滞后链）。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。•领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。目录•参与DNA复制的物质底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3’-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi目录目录•聚合反应的特点除了底物和酶外，DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5’→3’方向进行。目录二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.5'→3'的聚合酶活性2.核酸外切酶活性目录5´AGCTTCAGGATA3´|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´•3'→5'外切酶活性•5'→3'外切酶活性?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。•核酸外切酶活性目录目录目录目录目录目录目录目录功能：①5′→3′聚合酶活性；酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才发挥聚合作用②3′→5′外切酶活性；主要是对新生DNA链进行校对，防止“错配”③5′→3′外切酶活性。主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物的切除及其空隙的填补可见，DNApolⅠ是1个多功能酶目录323个氨基酸小片段5'→3'核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸DNA聚合酶活性3'→5'核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ•Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。目录功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-polⅢ(250kD)目录目录α亚基具有5′→3′方向合成DNA的催化活性ε亚基具有3′→5′外切酶活性，起校对功能，可提高聚合酶Ⅲ复制DNA的保真性亚基可能起组建的作用β亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA分子向前滑动亚基起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成-复合物，主要功能是帮助亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有增强核心酶活性的作用目录（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol目录目录（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白理顺DNA链拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）通用名功能原核生物复制起始的相关蛋白质目录•解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链•引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶•单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整目录•拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ•分类目录目录目录目录目录目录五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。以NＡＤ＋（大肠杆菌）或ＡＴＰ（真核细胞）为能源。•DNA连接酶(DNAligase)作用方式POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’目录目录目录•DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。•在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。•也是基因工程的重要工具酶之一。•功能目录（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成目录原核生物E.coli为例复制由起始点oriC(origin)开始双向复制E.coli的复制起始点oriC（245bp的DNA组分）序列分析有如下特点3组串连重复序列(13bp），每个顺序都由GATC开始2组反向重复序列(9bp)4个dnaA蛋白结合部位目录1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。目录目录目录DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶SSB3535引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。目录3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物目录目录DNA复制的调控是在起始阶段进行的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不在同一点上（不对称复制，如D环复制）。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是富含A.T。目录（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。目录5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目录领头链的合成目录随从链的合成目录目录目录目录目录目录目录•原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriterE.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止目录细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子(terminator)位点，E.coli有7个终止子位点。目录新合成的两条染色体DNA分子相互连在一起，被拓扑异构酶IV分离目录DNA复制的分子机制的基本特点复制的结果是半保留复制，复制的过程是半不连续复制。复制以复制单位进行，起始于特定的位点（复制起点）。复制可以是单向，也可以是双向，后者更为常见。复制时，DNA的两条链都从5′端向3′端延伸。目录前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。DNA的合成始于RNA引物的合成，因此前导链只有一次RNA合成，滞后链的冈崎片断每个都有RNA引物的合成。RNA引物随后由DNA片段替换，相邻的DNA片段连接形成一条完整的DNA链。DNA聚合酶的校对功能和细胞的错误修复功能维持DNA分子的准确性和忠实性。目录哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。目录•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始目录3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长目录•染色体DNA呈线状，复制在末端停止。•复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。•染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止53355335+5333355目录目录2009年诺贝尔生理学/医学奖：端粒和端粒酶如何保护染色体目录•端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…目录•端粒酶(telomerase)•端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)•端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)•端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)组成目录端粒酶的爬行模型（动画演示）目录目录真核生物DNA复制的特点4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。1