IMS在食源性致病微生物快速检测中的应用2

应用磁免疫捕获技术建立食源性致病菌快速检验标准方法研究浙江省质量技术监督检测研究院浙江省食品质量安全检测院2008年10月31日食品微生物检测技术发展趋势食品微生物检测从检测原理可分为基于全细胞和细胞分子二大类型；现在的技术发展趋势是将二者的检测优势结合起来研发基于特异微生物细胞靶分子的新型全细胞筛选检测方法，并和仪器自动化相结合以达到更加快速和特异的高通量检测能力；磁免疫分离技术（IMS）、流式细胞检测分析技术（Flowcytometry）、表面等离子共振技术（SPR）等。免疫磁分离技术（IMS）免疫磁性分离技术是利用抗原抗体的高度特异性识别作用，使抗体固定于免疫磁性微球（IMMS）表面，与检样中的抗原结合形成免疫磁珠-靶细胞复合体，通过外加磁场作用达到与其他组分分离目的。免疫磁分离技术（IMS）作为一种新型的免疫分离技术现已广泛应用于生物技术检测领域；利用磁免疫技术可以快速地从食品、环境和临床样本中分离目标微生物和致病菌，展现了广阔的研究与应用前景在食品微生物检测领域的应用在食源性致病菌的检测中，磁免疫技术可以在含有大量杂菌的食品悬液中有选择性地分离出目标病原微生物，实现食源性致病菌的快速初筛，分离的微生物可与PCR、ELISA、DNA探针、荧光显微镜及显色培养基等技术结合，实现病原菌的准确鉴定，是目前致病菌实时快速检测中最有潜力的技术方向。免疫磁珠（IMB）免疫磁珠（ImmunomagneticBeads，IMB），是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。品牌国别主要材质检测项目技术缩写Matrix英国合成磁性材料致病菌检测IMSDynalbeads挪威γFe2O3和Fe3O4磁性材料食源性致病菌和细胞生物分离AIMSMiltenyiBiotec德国与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒高度特异性细胞分选MACS表.免疫磁珠产品现状磁免疫分离原理外加磁场捕获磁珠磁珠捕获样品中微生物洗涤去除非特异成分撤离磁场，浓缩磁珠复合物进一步确认最快较快较慢英国Pathatrix磁免疫检测系统一、IMS在沙门氏菌检测中的应用沙门氏菌是食源性病原菌中分布最广、危害最大的肠道致病菌之一，也是引起食物中毒最常见的菌属之一。属肠杆菌科，为短杆状无芽孢的革兰氏阴性菌，广泛分布在动物源性食品和环境中，迄今为止共发现有2500种以上的菌株型（也称作血清型），主要通过食物传播。沙门氏菌病导致的食物中毒的典型症状包括水样腹泻、恶心、腹痛、中等发热和寒战，有时伴有呕吐、头痛和倦怠。沙门氏菌显微图谱沙门氏菌基因组图谱沙门氏菌致病因子无论是在发达国家还是在发展中国家，由沙门氏菌引起的食源性疾病对食品公共安全都是潜在的威胁，也是重点的防控对象。今年４月中旬以来，圣保罗沙门氏菌造成沙门氏菌病疫情在美国多个州蔓延，美国各地迄今已接到９４３人感染沙门氏菌的报告，其中１３０人因病情严重而住院，我国国家质检总局因此发布《关于防止美国沙门氏菌病传入我国的公告》；在欧洲丹麦，因沙门氏菌引发的食源性疾病每年的经济损失估算约为1550万美金（2001年），约占GDP总值的0.01％，今年丹麦暴发１５年来最大规模的沙门氏菌病疫情，全国有３０００至４０００人受到感染。对沙门氏菌的检验方法和控制技术的研究一直是食品安全科研工作重要方向。从食品中分离和鉴定沙门氏菌，常规的检验流程为前增菌选择性增菌选择性平板分离培养细菌生化鉴定和免疫血清鉴定定性报告（GB/T4789.4）；常规的食品沙门氏菌检测方法检测周期长，操作烦琐，人工因素多且灵敏度低，容易造成错检和漏检，难以应对食品安全事件中快速准确的检验要求；发展快速灵敏的食品沙门氏菌检测技术已成为我国食品质检机构技术创新的重要科研方向。常规食品沙门氏菌检验食品沙门氏菌磁免疫分离检测技术研究策略通过大量的筛选验证实验建立灵敏、特异、快速的检测流程和技术参数；在实验室研究工作基础上制订相应的检测技术标准文本，并向标准化管理部门提出立项申请。达到的技术要求检测适用范围覆盖中国食品种类的大部分，沙门氏菌检测限10cfu/25g(ml)；检测时间周期40小时；检测特异性98%；交叉反应性和假阳性率2％食品沙门氏菌磁免疫分离检测方法研究磁免疫检测方法的适用性研究对显色培养基中典型菌落鉴定实验ELISA免疫学检测验证MiniVIDAS+VITEK验证PCR分子检测验证磁免疫检测方法的特异性研究样品名称自然样品污染样品（加样量：cfu/25g@Salmonella-entericasubsATCC10708）备注10510310脱水蔬菜-+++++“+++”为多不可计;“++”300～3000个菌落;“+”0～300个菌落;“+/-”不能确定;“-”无菌落;Chromagar显色培养基沙门氏菌典型菌落为紫红色型菌落牛奶-+++++豆奶-+++++苹果汁-++++/-西红柿-+++++火腿肠-+++++/-生鲜鱼-+++++/-冷冻虾-+++++阳性对照-++++++空白----1.磁免疫捕获筛选技术适用性研究2.IMS筛选后Chromagar显色培养基上的沙门氏菌典型菌落标准菌株：Salmonella-entericasubsATCC107083.典型菌落VITEK仪器鉴定结果VITEK确认显色培养基上的典型菌落为沙门氏菌4.荧光定量PCR方法验证结果保温40次循环保温42°C5分钟94°C5分钟①94°C5秒②60°C40秒37°C恒温增菌液浓度2×106CFU/mL2×103CFU/mL阴性对照空白对照强阳性对照反应结果强阳性弱阳性反应结果正常反应条件反应结果5.特异性和交叉性反应研究实验结果表明磁免疫技术在102株沙门氏菌菌株中的特异性为100%，与32非沙门氏菌属的菌株中无交叉反应，显示了磁免疫技术有较好的特异性和灵敏度。从理论上分析，其他非目标菌也有被磁珠非特异性吸附到平皿的可能性，但后续的选择性培养及生化和血清学检测可以有效排除非特异性的干扰菌。实验研究结论验证实验显示磁免疫筛选技术适用于各类食品基质中的沙门氏菌的快速检测，且有较好的灵敏度和特异性，检测限可达到1～10cfu／g，检测时间≤40小时。IMS技术可以和显色培养基、PCR、ELISA以及微生物仪器鉴定等方法联用，也可以与常规的细菌生化和血清学联用，可对其筛选结果进行快速的确认，为食源性致病菌的检测技术和鉴定提供了有效的快速筛选技术。6.食品沙门氏菌磁免疫检测技术标准制订实验室验证比对的基础上形成了检测技术标准草案文本，并申请了国家标准《食源性沙门氏菌的快速检测法：免疫磁珠分离鉴定法》制订项目；同时委托同行检测单位对本检测技术标准涉及的适用性、特异性、灵敏度等技术指标进行充分验证。二、IMS在婴幼儿奶粉阪畸肠杆菌E.sakazakii检测中的应用EnterobactersakazakiiATCC51329建立了婴幼儿奶粉中阪畸肠杆菌免疫磁珠检测方法技术流程现正优化检测参数制订相应的检测技术标准免疫磁珠筛选后E.sakazakii在显色培养基上的典型菌落三、生活饮用水隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测1.水样过滤、淘洗2.磁免疫分离抗Cryptosporidum免疫磁珠抗Giardia免疫磁珠3.荧光染色计数FA/DAPIDIC结论应用磁免疫检测技术建立了食品关键性致病菌沙门氏菌快速，特异和灵敏的原位实时磁免疫检测方法。通过本项目研究建立的磁免疫分离检测技术具有较好的通用性,扩展性检测研究表明磁免疫技术可扩展到其他食源性致病菌的分离鉴定,实现该技术的系列化,为食源性致病菌的快速检测和有效监控提供新技术支撑。进一步研究工作完善检测技术，形成科学合理的检测技术标准推广成果应用,形成检测技术平台并提供技术服务