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当前位置:首页 > 商业/管理/HR > 资本运营 > 第22章 层析分离法
生物分离工程精品课程主讲:赵延斌层析分离法22层析分离法(第一讲)第一讲概述特点:(1)纯化倍数高(2)操作规模小,放大困难(3)终产品纯化(4)适用于价格昂贵的产品层析分离分类(1)层析分离法第一讲按溶质分子与固定相相互作用机理吸附层析(范德华力,氢键,静电力,共价力)分配层析(溶质在两液相间分配系数不同)凝胶过滤(分子大小与形状)实验技术分类低压(小于0.5Mpa)中压(0.5-5Mpa)高压(5-40Mpa)电泳(溶质在电场中移动)层析分离分类(2)层析分离法第一讲根据固定相形状分类柱层析纸层析薄层层析根据流动相分类气相层析液相层析超临界流体层析按操作方式分类迎头法(frontalanalysis)顶替法(displacementanalysis)洗脱分析(elutionanalysis)基本概念层析分离法第一讲(1)分配系数溶质在固定相与流动相浓度比值(2)解离常数吸附质浓度与吸附剂浓度乘积与吸附复合物浓度比值(3)分离因素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数(4)阻滞因子分配层析溶质移动速度与理想流动相移动速度(距离)比值(5)溶出体积在柱色层分离中,使溶质从柱中流出时所通过的流动相体积(6)分辨率两峰之间的距离与两峰宽的平均什之比(7)理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高(8)溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总之比第一讲层析分离法分配系数层析分离法第一讲Kd=C1/C1Kd为分配系数C1,C2为两液相中的溶质浓度。应用条件:温度一定低浓度分离度层析分离法第一讲第一讲层析分离法的移动距离前缘在同一时间内溶剂溶质的移动距离移动速度流动相在层析系统中的溶质的移动速度)(fRsdmAKAVV积能进行分配的有效截面溶质移动距离Rf=sdmmAKAA第一讲层析分离法洗脱容积层析分离法第一讲第一讲层析分离法理论塔板第一讲rrnrEEErnrnf)1()11()!(!!222)1/(2)1/()1/(21EnEEnEreEnEfrr=nE/(E+1)时rmax=nE/(E+1)最大浓度塔板rmax=nE/(E+1)层析分离法第一讲层析分离法思考题层析分离法第一讲1想解概念:解离常数,分离因素,阻滞因子,理论塔板高度,洗胶体积,分辨率2不同的层析分类方法各有何意义?层析分离法(第二讲)第二讲层析分离法层析介质层析分离法第二讲要求:(1)不溶于流动相(2)化学稳定(3)机械强度(4)大的表面积(5)粒度均匀层析介质种类无机(氧化铝,硅胶,活性碳)有机(琼脂糖,纤维素,聚丙烯酰胺)常用层析介质层析分离法第二讲氧化铝:(活性氧化铝)它是一种多孔性、高分散度固体(1)有很大的比表面积,其微孔表面具有吸附性能。(2)分子式AI2O3简单,空间形态复杂,8种以上的形态(3)同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径分布、比表面积等存在差异(4)吸附量与含水量关系很大制备:由氢氧化铝加热脱水得到的。吸附基团:铝离子种类:碱性:由氢氧化铝高温脱水,用于碱性稳定的溶质酸性:碱性氧化铝经盐酸洗涤,用于在酸性稳定的溶质中性:碱性氧化铝经水洗后活化制得应用:有机溶剂中分离天然成分第二讲层析分离法硅胶层析分离法第二讲硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质(1)化学组成SiO2.XH20,(2)属于无定形结构,基本结构质点为Si一O四面体,相互堆积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。(3)硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。硅胶的分类(常以孔径大小来分),(1)特细孔硅胶(0.8nm以下)。(2)细孔硅胶(1.5—2.0nm)(3)中孔硅胶(4.0一5.0nm)(4)粗孔硅胶(10.nm以上)应用:吸附层析剂与分配层析剂优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物,用于天然产物分离,可用在水溶液中或有机溶剂中琼脂糖层析分离法第二讲由海洋生物琼脂提取得到的主要成分(1)中性不带电(2)水溶性线状多糖(3)高亲水性,含大量羟基(4)能制成多孔性凝胶,分离大分子制备:(1)去除带电琼胶成分(2)将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制得珠状介质。(3)采用交联剂增加介质的机械强度琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构a琼脂糖结构b亲水性凝胶结构第二讲层析分离法琼脂糖(2)层析分离法第二讲介质商品种类Sepharose2B,Sepharose4B,Sepharose6B。经过交联而增加机械强度的琼脂糖SepharoseCL-2B,SepharoseCL-4B,SepharoseCL-6B应用水溶液中分离蛋白质葡聚糖层析分离法第二讲α-1,6相连的葡萄糖聚合物,由环氧氯丙烷交联得到珠粒性质:(1)亲水性比琼脂糖高(羟基数多)(2)化学稳定性及热稳定性好(3)孔度与机械强度与交联度有关(4)用于凝胶过滤分子筛应用:水溶液中分离蛋白质等纤维素层析分离法第二讲β-1,4相连的D-葡萄糖(偶而有1,6键合)线性天然高聚物(1)亲水(2)微晶与无定型两部分组成,缺乏孔度大孔珠状纤维素(1)高孔度(2)高机械强度(3)亲水性强应用:离子交换分离蛋白质介质聚丙烯酰胺层析分离法第二讲性质:(1)丙烯酰胺与交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺共聚(2)烷烃骨架与酰胺侧链(3)控制交联剂比例可控制网格孔度(4)亲水好,但不如多糖介质(5)机械强度差应用:(1)凝胶过滤(2)电泳介质亲和层析层析分离法第二讲亲和层析(AffinityChromatography)是利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。生物体内相互作用的分子对:(1)酶—底物或抑制剂(2)抗原—抗体。(3)激素—受体。(4)糖蛋白与凝集素,(5)生物素—生物素结合蛋白等基质活化方法与配基偶联层析分离法第二讲活化(activation):基质(matrix)上的化学基团是不活泼的,无法与配基直接偶联,通过化学反应使介质上化学基团处于活化状态。(1)大分子配基如蛋白质等可与活化基质直接偶联。(2)小分子配基,在基质与配基之间插入若干碳原子手臂(spacer),然后再与配基偶联。(3)环氧氯丙烷,1,4-丁二醇缩水甘油醚本身是活化剂亦具有手臂作用。活化方法(1)层析分离法第二讲A溴化氰法溴化氰在碱性条件下与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯到基质上,进而与配基偶联优点:(1)适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质(2)用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联(3)操作步骤简单,重现性好。(4)偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。缺点:(1)形成的异脲键易产生非特异性吸附,(2)共价键不稳定,配基容易脱落,(3)活化操作危险性大,反应后的残余液需经处理再排放溴化氰活化与配基偶联化学反应式第二讲层析分离法活化方法(2)层析分离法第二讲B环氧氯丙烷活化(1)所形成的共价键稳定,配基不易落脱(2)自动引入手臂,(3)有更小的非特异性吸附,(4)活化操作简单易行,危险性相对较小缺点:在强碱性条件反应,不适用于碱敏感物质。环氧氯丙烷活化反应式第二讲层析分离法环氧基的氨化及偶联配基反应第二讲层析分离法思考题层析分离法第二讲1常用的层析介质有哪些?各适用于何种状况下的分离?2亲和层析的机理是什么?层析法(第三讲)第三讲层析分离法活化方法(3)层析分离法第三讲C对甲苯磺酰氯活化(1)用于活化含羟基基质,将羟基转化为磺酰基,在配基偶联后容易脱落,不引入电荷。(2)配基与羟基间形成稳定化学键。(3)活化操作需在无水丙酮环境中进行。偶联配基根据情况,既可在有机相中进行,亦可在水相中进行对甲苯磺酰氯活化反应式第三讲层析分离法手臂(spacer)层析分离法第三讲作用:减少亲和作用空间位阻连接:通过化学反应与活化基团连接手臂化合物:乙二胺NH2-CH2-CH2-NH2已二胺NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH环氧氯丙烷1,4-丁二醇缩水甘油醚残余电荷的掩蔽层析分离法第三讲目的:防止产生非特异性吸附原理:通过化学反应消除基团上的电荷方法:(1)自发水解(2)氨基:醋酸酐(3)羧基:水溶性碳二亚胺
本文标题:第22章 层析分离法
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