第四章-2 基因工程

基因工程——目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建CPCR法BcDNA法A鸟枪法D化学合成法E基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。A鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连接前将DNA片段进行分级分离2.0kb1.6kb1.8kb鸟枪法操作的改进冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝胶DNA片段回收技术鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构BcDNA法cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNAlibrariescDNA基因克隆cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。cDNAlibrariesmRNAisolation,purificationChecktheRNAintegrityFractionateandenrichmRNASynthesisofcDNATreatmentofcDNAendsLigationtovectorcDNA文库1.没有原核生物的cDNA文库•原核生物的mRNA非常不稳定；•原核生物的基因组文库比较容易构建，能包含所有基因的序列。2.cDNA文库对于真核生物的基因分析•cDNA文库是只含有编码蛋白的基因文库•cDNAs没有内含子基因可以在E.coli中直接表达•用于新基因的鉴别•组织或特殊类型细胞（基因的特异表达）cDNA文库cDNA文库-mRNA分离•大部分真核生物的mRNAs有3’poly（A）尾巴•oligo(dT)能与poly(A)尾巴互补，由此来获得mRNA.AAAAAAAAAAn5’cap1.传统的分离方法是用oligo(dT)-纤维素柱分离总RNA2.把oligo(dT)-磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA3.用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA三种分离mRNA的方法用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图确定mRNA没被降解方法:mRNA的翻译:用体外蛋白质合成检测mRNAs。（麦胚无细胞转译体系或兔网织细胞裂解物转译体系）通过凝胶电泳分析mRNAs:用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳cDNA文库-检测mRNA的完整性克隆特殊的mRNAs克隆一个特殊的基因比建立完整的cDNA文库更有用凝胶分离:通过琼脂糖凝胶电泳回收mRNAs（根据mRNA的大小）富集:通过杂交来实现cDNA的合成:第一链的合成:mRNA,反转录酶，oligo(dT)，核酸末端转移酶，dNTPs1.oligo(dT)引导的cDNA合成法2.随机引物引导的cDNA合成法第二链的合成:根据在第一链3’-末端加尾（C），用补充引物合成第二链cDNA法克隆目的基因的基本战略mDNAcDNA第一链的合成5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPscDNA第二链的合成煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTOH3’KlenowdNTPsS1cDNA第二链的合成DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAp5’5’S1AAAATTTOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH3’AAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-DNAligasecDNA第二链的合成dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5GGAAAAAOH3’TTTTTp5’3‘HO5‘ppp’5GGAAAAACCCCCCCOH3’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGG3‘HOCCCCCCCTTTTTp5’5‘pGGGGGGGAAAAAOH3’NaOH退火KlenowdNTPscDNA法克隆目的基因的基本战略双链cDNA的克隆双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收cDNA法分离目的基因的基本程序完备分离程序提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等cDNA法分离目的基因的基本程序特异分离程序提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能差异分离程序多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆cDNA克隆的优越性1.以mRNA为材料；（一些RNA病毒，不经过DNA中间体，对其研究，cDNA是唯一可行的方法）2.基因文库的筛选比较简单易行；3.由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性的几率比较低；4.克隆在细菌中表达的基因，用作基因序列的测定，和发育过程中或组织中基因特异表达cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因CPCR法目的基因的克隆与基因文库的构建PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物PCR法定向扩增目的基因的基本原理5‘5‘目的基因5‘变性加热5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加热变性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR扩增产物T载体T7lacZMCSoriAprD化学合成法目的基因的克隆与基因文库的构建化学合成法的基本战略化学合成的单元操作DNA化学合成的用途化学合成法的基本战略全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：小片段粘接法：混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体化学合成法的基本战略全基因合成补钉延长法：混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合化学合成法的基本战略全基因合成大片段酶促法：混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合化学合成法的基本战略全基因合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之