第2章 蛋白质化学-2012

第二章蛋白质主要内容介绍蛋白质的构件单位氨基酸的结构、分类、性质,肽的概念，重点讨论蛋白质的分子结构、性质以及结构和功能的相互关系。难点与重点：AA的结构与性质Pr的分子结构与功能第一节蛋白质概论第二节氨基酸**第四节蛋白质的分子结构**第五节Pr结构与功能的关系**第六节蛋白质的理化性质**第七节蛋白质的分离纯化与鉴定第三节肽第一节蛋白质概论一、蛋白质元素组成与分类1、元素组成碳50%氢7%氧23%氮16%硫0-3%微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼凯氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白质含量=蛋白氮×6.251克氮相当于6.25克蛋白质，称为蛋白质系数2、分类球状蛋白纤维状蛋白按蛋白质的分子形状分按化学组分分单纯蛋白质结合蛋白质按功能分活性蛋白（酶蛋白、受体蛋白……)非活性蛋白（硬蛋白、角蛋白)单纯蛋白质：仅由a-AA组成的Pr。根据溶解度不同又分为：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白。结合蛋白质：由AA和辅因子组成。根据辅基的不同可分为：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红蛋白、黄素蛋白、金属蛋白。少于50个AA称为肽多于50个AA的称为蛋白质蛋白质分子量=AA数目*110二、蛋白质分子的大小与分子量催化功能；结构功能；调节功能；防御功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能蛋白质是生命活动的体现者.三、蛋白质功能的多样性第二节氨基酸一、氨基酸的分类*蛋白质氨基酸：蛋白质中常见20种氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：羟基化的AA、甲基化的AA，是蛋白质氨基酸的衍生物，如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：不存在于蛋白质中，是蛋白质常见AA的衍生物，也有D型或一些β-、γ-或δ-AA稀有的蛋白质氨基酸.非蛋白质氨基酸.蛋白质AA的结构通式及特点：1、α-碳原子上均有一个氨基和一个羧基。2、除Pro为α-亚AA外，其余氨基酸均为α-AA。3、除Gly外，其余氨基酸都有一个不对称碳原子，有旋光性。4、除Gly外，其余蛋白质AA都是L型AA。CHRCOO-+NH3α二、组成Pr的20中常见AA的结构和符号20种常见蛋白质AA的分类、结构及三字符号：按R基团极性分类脂肪族AA杂环AA（HisPro)芳香族AA(PheTyrTrp)按营养学分类必需AA（8种）非必需AA（12种）按R基团极性分类非极性R基团AA(8种）极性R基团AA不带电荷（7种）带电荷负电荷（2种）正电荷（3种）AlaValLeuIleProPheTrpMetGlySerThrCysTyrAsnGlnAspGluHisLysArg（12种）注意特殊的AA！！！从营养学的角度可分为：（1）非必需AA（12种）：可由动物和人体自身合成。（2）必需AA（8种）：不能在生物体（动物、人体）内转化合成，必需由食物供给的氨基酸。ValIleLeuPheMetTrpThrLysArgHis三、氨基酸的两性解离和等电点原因：α-羧基pK1在2.0左右，当pH3.5，α-COO以-COO-形式存在。α-氨基pK2在9.4左右，当pH8.0时，α-NH2以α-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0时，带有相反电荷。氨基酸在水溶液中是以两性离子形式存在依照酸、碱质子理论,酸是质子的供体，碱是质子的受体。氨基酸在水中即起酸的作用(供体)也起碱的作用(质子的受体)在酸性条件下,丙aa以阳离子形式存在，可以看作是一个二元弱酸，有两个可以解离的H+，即COOH上的H+和NH3上的H+。它的分解步骤如下:物质的解离常数是用滴定曲线的实验方法求得,画出曲线。加入酸碱使丙aa净电荷等于0时,丙aa所带正、负电荷相等,这时的pH值就是丙aa的等电点。pI:两性电解质所带正负电荷相等时溶液的pH值pI=两性离子状态两侧的基团pK’值之和的一半(2.34+9.69)/2=6.02。中性AA的等电点不是pH7，而是小于7，在pH6.0左右，如：Val=5.96，Ala=6.02，Ser=5.68，这是因为AA中羧基的解离度大于氨基的解离度。归纳AA等电点的计算:谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算BApK1pK2pIpIpK3pK3pK2pK1加入的OH-mL数加入的OH-mL数一氨基二羧基AA的等电点计算：pI=2pK´1+pK´R二氨基一羧基AA的等电点计算：pI=2pK´2+pK´RHis的咪唑基的pKa值是最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。pHpI时，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动。pH=pI时，氨基酸净电荷为零pHpI时，氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动。例1：pH6.0时将Gly,Ala,Asp,Lys,Arg,Ser混合物点样于滤纸中央，接上电源进行纸电泳。请分析说明可能的电泳结果。分析：Gly,Ala,Ser的pI为6.0左右，在pH6.0时净电荷为零，在电场中不移动；Asp的pI小于6.0，在pH6.0时带负电荷，向正极移动；Lys,Arg的pI大于6.0，在pH6.0时带正电荷，向负极移动。根据Glu的数据（pK1α-COOH2.19，pK2α-N+H39.67，pKRR-COOH4.25，pI3.22）（1）绘出滴定曲线（2）指出Glu-和Glu=各一半时的pH值（3）指出Glu总是带正电荷的pH范围（4）指出Glu±和Glu-能作为缓冲液使用的pH范围（5）欲配制谷氨酸，最好的缓冲范围应选择在何处？例2：（1）解：见图（2）Glu-和Glu=各50%时pH为9.67（3）pH3.22时Glu总带正电荷（4）Glu±和Glu-缓冲范围pH4.25左右（5）缓冲能力是指加入酸碱是溶液抗pH的能力。缓冲剂起作用的pH范围称为缓冲范围，通常定义为pKa1。谷氨酸有三个可解离基团，有三个最佳缓冲范围，分别是2.21，4.31，9.711、氨基酸的构型与旋光性Gly一种构型,无旋光性Thr和Ile有四种光学异构体。其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。构成蛋白质的氨基酸均属L-型。四、氨基酸的构型、旋光性和光吸收Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键，在220-300nm近紫外区有吸收。280nmλ（nm）εTyr2751.4×103Phe2572.0×102Trp2805.6×103Lambert-Beer：LcTIIA.1lglg透入2、氨基酸的光吸收性1、与丹磺酰氯（ＤＮＳ）的反应用以检测多肽链的Ｎ－末端。DNS＋R-CH-NH2DNS-AA＋HClCOOH（有荧光）DNS-AA在紫外光激发后发黄绿色荧光五、氨基酸的化学反应DNS-Cl可用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记。Gly—Ala—Ser—Leu—PheDNS—Gly—Ala—Ser—Leu—Phe水解产物：DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-氨基酸被紫外光激发后发黄绿色荧光。氨基酸氨基的一个H原子可被烃基取代2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱溶液中与AA反应生成2,4-二硝基苯基氨基酸英国的Sanger用这个反应鉴定多肽N-未端的氨基酸,用以测定多肽或蛋白质的AA排序2、烃基化反应二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸）呈黄色，层析法鉴定。被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。Sanger反应现在根据此原理设计出了“蛋白质顺序测定仪”Edman反应与苯异硫氰酸酯（PITC）在弱碱条件下形成相应的苯氨基硫甲酰（PTC)衍生物,与酸发生环化生成PTH-aa,这是著名的Edman降解,进行多肽链N-未端氨基酸测定。苯乙内酰硫脲衍生物3、茚三酮反应茚三酮在弱酸性溶液中与a-氨基酸共热，生成蓝紫色物质。脯氨酸或羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物用于氨基酸定量定性测定4、成肽反应氨基酸合成肽的反应基础第三节肽一、肽和肽链的结构和命名肽：由一AA的羧基和另一AA的氨基脱水缩合而成的化合物。肽键：AA之间脱水后形成的共价键，又称酰胺键。AA残基：指的是肽链中的AA单位，不是完整的AA分子。肽的命名是根据氨基酸残基的数目决定的：寡肽：十个以下AA残基组成的肽。多肽：超过10个AA残基组成的肽。多肽链：由多个AA以肽键连接的一条链。肽单位：由CO和NH构成肽键的四个原子和与之相连的两个α-碳原子构成的刚性平面或称酰胺平面。★多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个酰胺平面组成γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸谷胱甘肽（GSH)非a-羧基,如谷aa、天门冬aa的中非a-羧基可形成肽键。非a-氨基不能形成肽键。＃＃＃＃＃＃例如：谷胱甘肽（1）是一些酶的辅酶。（2）保护SH基酶。（3）防止过氧化物的积累。2G--SHG-S--S-G还原型氧化型谷胱甘肽的功能：※GS－SG短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。在多肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。二、肽的酸碱性质三、天然存在的活性肽1.谷胱甘肽Glu—Cys—Gly2.短杆菌肽（抗生素）由短杆菌产生的环10肽，抗菌。3.脑啡肽（5肽，具有镇痛作用，已发现几十种）Met---脑啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—MetLeu---脑啡肽：Tyr—Gly—Gly—Phe—LeuLeu---脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。第四节蛋白质的分子结构Protein的结构层次一级结构（氨基酸顺序）Primary↓二级结构Secondary↓超二级结构Super↓构象结构域Domain高级结构↓三级结构(球状结构)Tertiary↓四级结构(多亚基聚集)Quaternary图蛋白质结构层次一、蛋白质一级结构一级结构：是指蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序和连接方式。蛋白质的一级结构也叫化学结构蛋白质一级结构的测定意义：protein一级结构(序列)中含有形成高级结构全部必需的信息，一级结构决定高级结构及功能。推断氨基酸序列（一级结构）空间结构预测空间结构（高级结构）功能（一）protein测序的基本策略对于一个纯protein，理想的方法是从N端直接测至C端，目前只能测60个N端氨基酸。1.直接法（测protein的序列）两种以上特异性裂解法：NCA法裂解A1A2A3A4B法裂解B1B2B3B42.间接法（测定核酸序列，推断氨基酸序列）（二）测序前的准备工作1.protein的纯度及均一性鉴定要求：纯度97%以上，均一。两种以上纯度鉴定方法才可靠。⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带⑵DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）测N端氨基酸2.测定分子量用于估算氨基酸残基数n=M/110方法：SDS-PAGE凝胶过滤法、沉降系数法、渗透压法（三）测定步骤1.测定protein分子中多肽链的数目2.拆分protein分子中的多肽链3.断裂链内二硫键4.测定多肽链的氨基酸组成（6mol/LHCl在110oC水解24h）5.分析多肽链的N末端和C末端6.多肽链部分裂解成肽段7.测定各个肽段的氨基酸顺序8.确定肽段在多肽链中的顺序9.确定多肽链中二硫键的位置将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质蛋白质序列测定的基本方法路线确定亚基种类及数目⑴拆离四级结构SDS-PAGE测亚基分子量8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍拆分多肽链⑵拆分二硫键过甲酸氧化—S—S—+HCOOOH→—SO3H或β巯基乙醇还原肽链的部分裂解和肽段的分离纯化1.化学裂解法①溴化氰—Met—X—产率85%②亚碘酰基苯甲酸—Trp—X—产率70-100%③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—2.酶法裂解①胰蛋白酶Lys—X(X≠Pro)，Arg—X②胰凝乳蛋白酶Tyr—X(X≠Pro)Trp—X，Phe—X③胃蛋白酶Phe(Trp、Tyr、Leu)—Phe(Trp、Tyr、Leu)A:Ala-PheGly-Lys-Asn-TyrHis-ValArg-TyrB:Ala-Phe-Gly-LysTyr-His-Va