淋巴细胞亚群检测方案

中国医学科学院北京协和医院崔巍写在课前的话在这一节课中针对淋巴细胞亚群检测做了一个方案性的设计。这个方案是结合国际的CLSI以及国内的检测现状而设置的。它只是针对淋巴细胞亚群，更具有针对性和特异性。目前临床上用流式细胞仪，主要的检测项目就是淋巴细胞亚群，在临床检测中应用比较广泛，技术较成熟，所以，更需要对它进行一个规范。淋巴细胞是白细胞中非常重要的一类。在正常情况下，各群淋巴细胞的数目和相对比例都在一定的范围内。那么临床常见的淋巴细胞亚群包括哪些项目？一、淋巴细胞亚群最常见的淋巴细胞亚群包括T细胞、B细胞、NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。这5个项目具有明确的临床意义，临床应用也很广泛。二、抗体组合方案对于淋巴细胞亚群检测不能通过单一的抗体来检测，必须通过抗体组合来进行检测。比较倡导的方案有以下几种：联合CD45的四色方案、联合CD45三色方案、双色方案、7-氨基放线菌素D（7-AAD），必要时采用7-AAD联合CD45方案。其中联合CD45四色方案在国内的一些大型医院已经开始应用，而且在国际上是一个比较推荐的首选方案。这是因为CD45能标记白细胞，可以去除红细胞，以及其他碎片的干扰。通过45标记后再分析45标记后的淋巴细胞表达，如果不存在CD45，有可能有细胞碎片，无法排除对淋巴细胞的干扰，所以联合CD45，无论是四色还是三色方案都是一个比较倡导的方案。（一）联合CD45的四色方案联合CD45的四色方案可以有两种组合抗体的选择。第一种是用CD45/CD3/CD4/CD8做四色标记，主要可以检测T3细胞、T4细胞、T8细胞这三种不同的亚群。另外，可以用CD45/CD3/CD19/CD16和（或）CD56做第二管的标记，用于检测T3细胞、B细胞和NK细胞。一般四色方案需有两种抗体检测，目前已经有比较稳定的商品化的试剂，推荐有条件的实验室推荐使用。（二）联合CD45的三色方案联合CD45的三色方案主要是有四种不同的试剂。1.CD45/CD3/CD4这个抗体组合主要用来检测T3细胞和T4细胞。2.CD45/CD3/CD8用来检测T3细胞和T8细胞。3.CD45/CD3/CD19用来检测T3细胞和B细胞。4.CD45/CD3/CD16和/或CD56用来检测T3细胞和NK细胞。（三）双色方案如果实验室在边远的地区，条件不足，只能做双色方案，但是在双色方案中建议要把CD3加进来，因为CD45能很好地将白细胞和其他的干扰细胞，尤其是红细胞进行区分。如果不能用CD45，最好能用到CD3，CD3可以特异的标记T淋巴细胞，T淋巴细胞和CD4做双标可以克服单一的CD4抗体。为此，双色方案中也分为四管，每管当中建议都包含有CD3。1.CD3/CD4用来检测T3细胞和T4细胞。2.CD3/CD8用来检测T3细胞和T8细胞。3.CD3/CD19用来检测T3细胞和B细胞。4.CD3/CD16和/或CD56用来检测T3细胞和NK细胞。尽管检测条件不允许做四色或三色的分析，但也至少要用CD3和其他的直标抗体进行双免疫荧光染色方案，不建议采用单色方案进行淋巴细胞亚群分析。（四）7-氨基放线菌素D(7-AAD)联合CD45方案1．目的对于超过24小时的标本或肉眼观察发现已经变质的标本，需使用7-氨基放线菌素D（7-AAD）结合CD45（评估淋巴细胞、单核细胞和粒细胞死亡）复染评估细胞活力。2.判定7-AAD荧光染料主要染活细胞，主要用来鉴定细胞活性。（1）7-AAD阴性者是活细胞群。（2）7-AAD阳性者为细胞膜不完整的死细胞群。（3）7-AAD阴性细胞群阴性细胞群计数为75%时为最低细胞活力。（4）对于细胞活力低于75%的标本，建议采用7-AAD结合CD45的方案，包括①～③的组合方案。三、数据采集和分析（一）联合CD45和SSC设门确定淋巴细胞群方案1和方案2都存在CD45，首先建议采用联合CD45和侧向散射光SSC设门来确定淋巴细胞群。它是准确分析淋巴细胞亚群的第一步，可以用于来定位淋巴细胞群，把淋巴细胞群找到，排除标本中非淋巴细胞或细胞碎片的干扰。首先在CD45/SSC散点图中，调整SSC，使所有白细胞群均可见。第二步是根据CD45强阳性细胞群设门或者划定区域。因为在CD45染色细胞中，淋巴细胞群呈现CD45强阳性和SSC弱表达。设门时尽可能包括所有淋巴细胞，仪器会给一个提示，一共是包括了多少淋巴细胞数。一般门内淋巴细胞数不低于95%，而且要排除单核细胞和嗜碱细胞的感染，因为单核和嗜碱在周围，很容易对淋巴细胞进行干扰。单核细胞的CD45呈弱表达，而SSC呈中等强度表达。嗜碱性粒细胞的CD45和SSC均为低表达。如果不能确定标记的淋巴细胞群是否被设门设的比较准确，里面是否含有其他细胞的干扰，还有一个办法就是将CD3/SSC、CD19/SSC以及CD56或CD（16+56）/SSC中T细胞、B细胞和NK细胞的分布特征筛选出来，并在CD45/SSC双参数散点图中显示，以监测设门的准确性。当设门准确了，准确的找到淋巴细胞后，才能采集细胞数。第三步，采集细胞数。非设门荧光散点图中，每一荧光通道至少收集5000个淋巴细胞，以确保对数量较少的淋巴细胞亚群（如占总淋巴细胞数的10%）提供足够量的细胞。从上面的图片上可以看到，图形中画黑框、标记是紫色的细胞是淋巴细胞群，在它的上方是单核细胞，用红颜色标记，嗜碱性细胞CD45和SSC的表达较低，用粉颜色标记的。（二）淋巴细胞亚群分析和相对计数首先在亚群分析时设置几个散点图：CD3/CD4散点图、CD3/CD8散点图、CD3/CD19散点图、CD3/CD56或CD（16+56）散点图。散点图设置完后，在每一个荧光散点图中再设一个四象限门，将CD45/SSC散点图中选定的淋巴细胞群中的表达该抗原的阴性细胞群和阳性细胞群区分开来。第三步，进行淋巴细胞亚群计数。T4细胞的计数，一般先得到一个相对计数，也称为百分比，比如CD3/CD4散点图中CD3+CD4+细胞群占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比，这叫做T4细胞的相对计数百分率。它占的是前一个散点图，在第一次设门的散定图中淋巴细胞的百分率。T8细胞相对计数是CD3/CD8散点图中CD3+CD8+细胞群占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比。B淋巴细胞计数是CD3/CD19散点图中CD3-CD19+细胞群占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比。NK细胞相对计数是为CD3/CD56或CD（16+56）散点图中CD3-CD56+细胞群或CD3-CD（16+56）+占CD45/SSC散点图中选定淋巴细胞群的百分比。T3细胞的百分率在四个散点图中都可以计数，因为每一个散点图中都含有CD3的标记。在CD3/CD4散点图中，计数为CD3+CD4-单阳性细胞群百分比和CD3+CD4+双阳性细胞群百分比的总和。在CD3/CD8散点图中也一样，计数为CD3+CD8-单阳性细胞群百分比和CD3+CD8+双阳性细胞群百分比的总和。在CD3/CD19散点图中，计数为CD3+CD19-细胞群百分比。在CD3/CD56或CD3/CD（16+56）散点图中，计数为CD3+CD56-或CD3-CD（16+56）-百分比和CD3+CD56+或CD3+CD（16+56）+百分比的总和。（三）淋巴细胞亚群的绝对计数根据淋巴细胞亚群相对计数结果，对于绝对计数来讲，通常有两种绝对计数的方法，一个是单平台法，一个是双平台法。单平台方法是采用了一个内部的计数，计数的微球。所有的数据都可以从流式细胞仪这一台仪器检测到，由专用软件直接计算生成，具体操作可以试剂操作说明书。双平台方法，白细胞计数需要与亚群分析使用同一标本进行测试，并在6个小时内完成。当白细胞计数不能准确获得时，不能用DP方法进行淋巴细胞绝对计数，只能采用SP方法。不能采用淋巴细胞计数来计算淋巴细胞亚群绝对计数。因为淋巴细胞计数在血细胞分析仪上表现出更大变异度，白细胞计数作为分母比淋巴细胞计数更为稳定。（四）数据分析可靠性的验证1.CD45在有些验证中要采用CD45，CD45在三色和四色抗体组合方案的每一标本管中均存在，这样它既可以对淋巴细胞群进行设门，因为它在每一管中都存在，也可以根据CD45表达情况和图形分布情况检测和评估样本管间的变异，所以这是一个很好的一个验证方法。2.CD3CD3在四色抗体组合方案和双色方案的每一标本管中均存在，对样本管间T3计数的重复性有一个要求，重复结果间的差异应≤3%，如果大于3%，说明样本管间的变异较大。当CD3在某一标本管中的计数与其他标本管之间的差值＞3%时，建议重新再检测这一管标本，必要时要重新进行染色、裂解系红包和固定等，有可能是在处理过程中出现了问题。3.T、B和NK细胞相对计数的总和在可靠性验证中还可以进一步通过监测T细胞总数、B细胞总数和NK细胞的总数，三个百分比的总和来看亚群做的好不好。T、B和NK细胞相对计数的总和应占淋巴细胞总数的100%±5%范围内，这也是一个很好的监测。4.T4细胞和T8细胞相对计数的总和一般来讲，T4（CD3+CD4+）细胞和T8（CD3+CD8+）细胞百分比的总和应该等同于T3（CD3+）细胞的百分比，变化范围在5%～10%。如果发现T4+T8远远低于或远远高于T3细胞时，就要考虑一些影响因素，比如考虑标本中可能包含大量异常T细胞亚群，如TCR-γδ+T细胞,CD3+CD4-CD8-或CD3+CD4+CD8dimT细胞。5.定量微球采集时间的稳定性在数据可靠性验证中，尤其对绝对计数时可以采用一些方法来进行监控，即采用定量微球采集时间的稳定性来进行监测。如果采集时间一直都很稳定，提示流式细胞仪的液流系统通畅，定量微球的加入量是准确的。如果采集时间不稳定，提示标本制备过程中出现问题，需要重新来制备这个标本。CD3在四色抗体组合方案和双色方案的每一标本管中均存在，对样本管间T3计数重复结果间的差异如果大于（）说明样本管间的变异较大A.5%B.3%C.6%D.10%正确答案：B解析：CD3在四色抗体组合方案和双色方案的每一标本管中均存在，对样本管间T3计数的重复性有一个要求，重复结果间的差异应≤3%，如果大于3%，说明样本管间的变异较大。当CD3在某一标本管中的计数与其他标本管之间的差值＞3%时，建议重新再检测这一管标本，必要时要重新进行染色、裂解红细胞和固定。四、对照（一）同型对照对于淋巴细胞亚群来讲，同型对照是不需要的，因为CD3、CD4和CD8的阳性细胞群和阴性细胞群都是独立成群，很容易区分，所以同型对照的意义不大。（二）阳性对照需要阳性对照，分为针对方法学的阳性对照，以及针对试剂的阳性对照。1.针对方法学的阳性对照（1）目的主要是监测流式细胞仪上机分析前的环节是否出现问题，包括裂解是不是完全、是不是染色效果很差。当由于红细胞裂解不完全或染色较差时，包括阳性对照在内的所有的标本结果都会出现偏差，所以这时阳性对照如果不好，就提示上机前的染色环节出现问题。（2）种类阳性对照可以用全血标本来做，也可以用商品化荧光微球试剂。（3）使用频率每次上机前都需要做阳性对照。2.评价试剂的阳性对照（1）目的检测新批号试剂和当前批号试剂的染色效率是否出现问题，当怀疑试剂出现问题时，采用该试剂与已知可接受性能批号的试剂同时操作进行验证。（2）种类阳性对照可以是全血标本，也可以是冻干淋巴细胞。（3）使用频率一般是在更换试剂前后来做。所谓“补偿”就是除去某一荧光素误入到其它荧光通道中的发射光信号，那么为什么需要进行调整荧光补偿？五、调整荧光补偿（一）目的对于淋巴细胞亚群分析至少要采用双色方案，最好采用四色方案，所以荧光补偿是非常重要的，表达一个检测结果是否有准确，完全受到的干扰是荧光补偿，是一个重要的因素。当光学检测通道的电压及增益发生变动，当仪器维修保养后，都要对补偿进行验证或重新调整。（二）方法调整的方式有手工的方式，还有软件自动补偿方式。（三）补偿试剂的选择1.一般选择与最强荧光信号相匹配的补偿试剂。2.三色抗体组合分析三色抗体组合分析时要通过含有荧光微球或细