结核病实验室诊断201609

结核病实验室诊断检验科任易1.结核病背景资料2.结核病常规检验3.结核病实验室诊断4.体外r-干扰素释放试验5.小结背景—结核病流行现状全球有三分之一人口（20亿）感染了结核杆菌我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4背景—结核病感染、传播、发病过程潜伏感染染肺病或其他疾病复发细菌在人体复制播散Disseminates发作Onset康复Recovery时间表Time诊断Diagnosis治疗Treatment痊愈≥2个月（months）背景—当前结核病的研究新型抗结核药物(50%)新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗(10%)JID2012:205(Suppl2),S147.背景—结核分枝杆菌基础•结核分枝杆菌（M.tuberculosis）简称为结核杆菌（tuberclebacilli）。早在1882年，德国细菌学家柯赫（RobertKoch）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。•在微生物分类中，结核分枝杆菌属于放线菌门、放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属•分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌背景—结核分枝杆菌基础•（1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核。•（2）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主要与其细胞壁内含大量脂质有关。主要包括：•①磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关•②分枝菌酸：与抗酸染色性有关•③索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关•④硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用•⑤蜡质D，可刺激机体的迟发型超敏反应。•（3）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫结核病患者的常规检验•三大常规（血常规、尿常规、大便常规）•血沉•血流变检测•肺结核患者血液粘滞性、凝固性、聚集性均增高，血流缓慢，易于促成肺内微血栓形成——《微循环学杂志》常规检测，无特异性。结核病患者的常规检验•腺苷脱氨酶（ADA）:其血清/浆膜腔积液比值更有意义。•C反应蛋白（CRP）:X线提示有空洞的结核病人比没有空洞的结核病人以及健康人显著升高。但是CRP正常不能排除结核病。——Infection.17(1):13-4,1989Jan-Feb•辅助治疗检测：肝功能、肾功能、血脂、血糖。。。。•NSE、AFU等指标用于鉴别诊断。•CA125标志的使用，可以作为结核病疗效判断指标。结核病与肺部肿瘤患者均升高。——《中国实用内科杂志》2003年第2期结核病患者的常规检验•超敏C反应蛋白：肺结核是结核分枝杆菌感染导致机体细胞免疫功能下降的慢性呼吸道传染病，患者血清中HS—CRP、免疫球蛋白、补体可发生改变。——《中国实验诊断学》2009年01期•降钙素原（PCT）•肺结核患者血清PCT水平明显低于社区获得性肺炎（CAP）患者，HIV阴性的肺结核患者血清PCT水平并不会明显增高，故可用于PTB和CAP的鉴别诊断，但当PCT水平大于正常值时，其预后价值较差。可作为肺结核和肺结核伴感染诊断的辅助指标。——[EurRespirJ2011;37(2):371]结核病实验室诊断技术简介1.结核抗体2.结核蛋白芯片3.体外r-干扰素试验4.结核杆菌分泌抗原1.涂片2.培养3.药敏4.菌型鉴定细菌学免疫学分子生物学其他1.HPLC2.质谱技术3.流式技术1.实时荧光定量PCR2.DNA3.RNA4.耐药基因突变5.菌型鉴定6.测序结核分枝杆菌形态学检测1.直接抹片法2.离心制片法1.抗酸染色2.荧光染色1.普通显微镜2.荧光显微镜3.自动阅片技术涂片染色镜检结核杆菌离心制片技术直接涂片法离心制片法合计阳性阴性阳性41041(15.9%)阴性17199216(84.1%)合计58（22.6%）199(77.4%)2572015年7月至2015年11月，对本院257例痰液和纤维支气管镜灌洗液进行直接涂片法和离心制片法比对验证试验，结果如下：结论：离心制片法的确能提高结核杆菌涂片检测的阳性率。结核杆菌自动阅片技术•2016年2月至2016年3月，本院对308例涂片进行人工阅片和计算机自动阅片比对试验；结果符合的为286例，总符合率为92.58%。结核分枝杆菌体外药敏试验结核杆菌体外药敏试验MIC测定法固体培养法液体仪器法液体微量法结核分枝杆菌体外药敏试验DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml10-3++++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible结核分枝杆菌体外药敏试验1234挑取菌落磨菌、稀释接种菌液孵育7-10天显色，读取结果结核分枝杆菌液体微量药敏结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验收集我院2015年8月至11月的临床分离菌株511例，使用液体微量显色法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的体外药敏试验。其中MDR-TB菌株75例（14.7%）。药物RFPINHSMEMBCPMOFXETHPASLVFMOFRFBAMIKANCLO耐药例数80146945850614149536260111387耐药率%15.728.618.411.49.811.98.09.610.412.111.72.22.517.0结核分枝杆菌体外药敏试验结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比对实验收集临床分离菌株和国家参比室的质控菌株117例，使用液体微量显色法和罗氏比例法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的比对实验。总符合率超过90%。结核病分子生物学诊断一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术结核病分子生物学诊断结果判断结核病分子生物学诊断溶解曲线法比例法药敏敏感度特异度阳性预测值%阴性预测值%总符合率%敏感耐药%%INH敏感110490.598.295.596.696.1耐药238RFP敏感103295.897.294.198.196.8耐药346收集我院样本库的临床分离菌株154例，进行了溶解曲线法耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在96%以上。并对耐药结果不相符的11株菌进行了基因测序分析，均证实有耐药基因突变。结核病分子生物学诊断二、结核分枝杆菌RNA检测(TB-RNA)RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA拷贝数≥DNA拷贝数更具临床意义:生命力旺盛的病原体RNA转录活跃RNA远不如DNA稳定，病原体死亡，RNA很快降解1.交叉污染少2.较好的愈后指标结核病分子生物学诊断统计今年我院住院患者179例，分析涂片、培养和TB-RNA检测报告，结果如下：患者类型例数TB-RNA阳性例数阳性率涂片阳性272385.2%涂片阴性1424128.9%培养阳性686291.1%培养阴性11121.8%我院涂片、培养阳性率分别为：15.1%和37.9%；TB-RNA的总阳性率为35.8%。结核病分子生物学诊断三、EasyNATTB-DNA检测（恒温扩增法）原理：将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异性引物、一对特异性探针，同时一次性完成TBDNA的扩增及杂交过程，然后用一次性核酸检测装置进行定性诊断。检测目标片段:目标为结核分枝杆菌特异性IS6110片段。结核病分子生物学诊断操作步骤结核病分子生物学诊断2015年6月，我科参加CTCTC“EasyNAT®结核分枝杆菌核酸检测试剂盒现场应用评估”项目,结果如下：患者类型例数EasyNATTB-DNA检测阳性率%阳性阴性涂片阳性770100.0涂片阴性432414.7培养阳性1091*90.0培养阴性400400.0注*：1例培养阳性最终鉴定为非结核分枝杆菌结核病分子生物学诊断四、Gen-XpertMTB/RIF•进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台•痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理•GeneXpert设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变•容易使用，不需要进行分子生物学培训•操作完全自动化，使用起来既容易又安全。结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与PCRTB-DNA检测的比较：•阳性符合率＝99.03％，阴性符合率＝92.61％，总符合率＝95.31％Gen-XpertPCRTB-DNA合计阳性阴性阳性20421225阴性2263265合计206284490结核病分子生物学诊断•涂片阳性肺结核:Xpert检出率=99.35％•涂片阴性肺结核:Xpert检出率=35.32％Gen-Xpert涂片结果合计阳性阴性阳性15271223阴性1130131合计153201354结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与BD960液体培养比较实验：•阳性符合率＝95.52％，阴性符合率＝95.51％，总符合率=95.51％Gen-Xpert培养+鉴定结果合计阳性阴性阳性21312225阴性10255265合计223267490结核病分子生物学诊断XpertMTB/RIF与比例法药敏比较实验：•阳性符合率＝96.88％，阴性符合率＝95.53％，总符合率＝95.73％，Gen-Xpert利福平药敏试验合计耐药（阳性）敏感（阴性）耐药（阳性）31839不确定022敏感（阴性）1171172合计32179211结核病分子生物学诊断WHO关于XpertMTB/RIF的建议•XpertMTB/RIF应该用于MDR-TB的高危人群、以便尽早发现MDR-TB患者，有效控制疫情。•XpertMTB/RIF在MDR或HIV问题不十分严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步检测。体外r-干扰素释放试验•蛋白质水平结核菌素试验（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TBGoldin-tube(QFT-GI)潜伏性结核（LTBI）体外r-干扰素释放试验γ干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素体外r-干扰素释放试验特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)体外r-干扰素释放试验阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）实验效果图体外r-干扰素释放试验•检测特异性的提高–帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药•检测灵敏度的提高–有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散•快速–48小时出结果体外r-干扰素释放试验•阴性结果•提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：•①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全/疾病；③实验非正常操作。•阳性结果•提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：•4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）体外r-干扰素释放试验WHO2014《潜伏结核感染管理指南》建议：•1、在HIV感染人群、与肺结核患者密切接触的成人和儿童、开始