《荧光分析技术》_第二章 荧光信号机制

第二章荧光信号机制2.1荧光探针2.2荧光信号机制2.1荧光探针(Fluorescentprobe)定义：建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。信号表达包括荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。图1，荧光探针的结构报告基团Fluorophore连接基团Spacer识别基团Receptor构成：1．识别结合基团(R)，能选择性地与被分析物结合，并使传感器所处的化学环境发生改变。2．信号报告基团(F)，把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。3．连接基团(S)，将信号报告基团和识别结合基团连接起来。分类：1，按发光材料类型：小分子有机荧光探针（Chemosensor）、生物荧光探针（Biosensor）和纳米荧光探针（Nanosensor）；ChemosensorBiosensorNanosensor2，按发射信号类型：增强/淬灭型（Turn-on/off）和比率型（Ratiometric）荧光探针；Turn-onfluorescentprobeRatiometricfluorescentprobe3，按发射波长类型：可见光（Visiblelight）和近红外（Near-infrared）荧光探针；Visiblelightprobe(350-650nm)Near-infraredprobe(650-900nm)4，按激发光类型：单光子（One-photon）、双光子（Two-photon）和上转换荧光探针。One-photonprobeTwo-photonprobe荧光探针的优点：•灵敏度高检测限低至纳摩尔级别•选择性好对特定分析物有响应•响应时间短•使用方便、成本低荧光光谱仪、便携式三用紫外仪•实时监测检测不同时段的信号变化•原位检测精准检测•可视化检测肉眼观察或荧光信号具体化•非破坏性检测保持生物样本的完整性由于具有上述优点，使得荧光探针在多个领域应用广泛，特别是在分子生物学、生物化学、医学等。2.2荧光分子探针的设计原理荧光分子探针的设计原理主要有以下几种：键合法、置换法和化学计量计法。1、键合法：是指将探针中的识别基团和荧光基团通过共价键连接起来设计荧光探针的方法。Reversible当识别基团与被分析物结合时会引起荧光基团的化学环境发生变化，通过颜色的改变、光谱的移动、荧光强度的增减等现象来表现，这些变化可被裸眼或者仪器识别。这是目前在设计金属离子荧光探针中应用最广泛的方法。Zn2+fluorescentprobe受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力（如氢键、范德华力等）作为理论指导，多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。2、置换法：是利用识别基团分别与荧光基团和被分析物结合能力的不同来实现对被分析物的检测。Reversible识别基团和荧光基团形成络合物，当被分析物加入到该体系中时，由于识别基团与被分析物的结合能力要强于识别基团与荧光基团的结合能力，因此被测物将荧光基团置换出来，从而引起了整个体系荧光等化学参数的变化，进而为仪器或者裸眼识别，该原理常用于设计阴离子荧光探针。Cu2+S2-Cu2+-S2-fluorescentprobe3、化学计量计法:是利用探针分子与识别客体之间特异不可逆的化学反应前后产生荧光信号的不同而对分析对象进行检测的一类探针。主要包括两种类型：一类是目标分子和探针分子发生化学反应后通过共价键相连接；另一类是目标离子催化了一个化学反应。第一类：Cysfluorescentprobe第二类：+特点和优点：基于化学计量计原理设计的荧光分子探针通常具有不可逆性、和较好的选择性和灵敏度。2.2荧光信号机制(Fluorescencesignalmechanisms)1、光诱导电子转移PET2、分子内电荷转移ICT3、荧光共振能量转移FRET4、共价键能量转移TBET5、聚集诱导发光AIE6、激发态分子内质子转移ESIPT7、扭曲分子内电荷转移TICT8、单体/激基缔合物M/E用于解释荧光探针与分析物作用前后荧光信号变化现象，主要包括：1,光诱导电子转移(PET,PhotoinducedElectronTransfer)光诱导电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移的过程。识别基团与被分析物结合之前，荧光基团受激发，最终被光激发到激发态的电子不能跃迁到基态，使得荧光基团的荧光淬灭。而识别基团与被分析物结合后，PET过程受阻，荧光基团的荧光得以恢复。PET荧光信号机制示意图PET荧光探针光谱变化的特点：只有荧光强度的变化，没有波长的移动。PET过程可以用前线轨道理论具体解释：若识别基团的HOMO或LOMO轨道介于荧光团两轨道能量之间，此时就可以发生识别基团与荧光团之间的电子转移而导致荧光的猝灭；当识别基团与分析物结合后，HOMO轨道能量降低或LUMO轨道能量升高，使PET受阻，激发态电子可以返回基态，荧光恢复。根据荧光团得失电子情况，分为a-PET（还原型）和d-PET（氧化型）两种类型。前线轨道解释a-PET荧光信号机制示意图hυeNohυCu+Cu+a-PET基于a-PET机理的Cu+荧光探针基于a-PET机理的Ag+荧光探针a-PETa-PET基于a-PET机理的PO43-荧光探针基于a-PET荧光机制探针的识别基团的特征？主要由杂原子（O,N,S）组成的配体，易与金属离子配位或者与阴离子形成氢键。前线轨道解释d-PET荧光信号机制示意图eNohυehυ通常带哪些官能团的识别基团适用于设计基于d-PET荧光机制的探针？LUMO轨道能量较低官能团，比如硝基(-NO2),α不饱和羰基等。BD-ssLPS+BD-ss基于d-PET机理的H2S2荧光探针基于d-PET机理的H2S荧光探针d-PET基于d-PET机理的Cys荧光探针2,分子内电荷转移(ICT,IntramolecularChargeTransfer)分子内电荷转移是指分子在激发态时发生分子内电子转移，造成正负电荷分离，形成分子电荷转移态。分子内电荷转移荧光探针分子通常是荧光团上同时连有供电子基团(电子给体，Donor)和吸电子基团(电子受体，Acceptor),通过π键提供电子转移的通道，形成强的推-拉作用的共轭体系，其吸电子基团或推电子基团本身充当识别基团的一部分。当识别基团和被分析物结合后，作为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推拉电能力发生的改变，整个体系的的π电子结构重新分布，荧光团的推-拉作用被抑制或强化，从而导致吸收光谱、发射光谱发生变化，主要是光谱红移或蓝移。情况一：供电子基团和分析物结合，会减弱其推供电子的能力，使得整个体系电荷分离程度减弱了，导致荧光光谱和吸收光谱蓝移(Blueshift)。光谱蓝移荧光淬灭OR分析物与供电子作用的ICT荧光机制示意图情况二：拉电子基团和分析物结合，会增强其拉供电子的能力，使得整个体系电荷分离程度增强了，导致荧光光谱和吸收光谱红移(Redshift)。光谱红移分析物与拉电子作用的ICT荧光机制示意图以上情况主要是针对金属离子探针。若拉电子基团与分析物作用之后拉电子能力减弱，会导致光谱蓝移。基于ICT机理的Zn2+荧光探针实例：ICT配位型金属离子荧光探针基于ICT机理的Zn2+荧光探针基于PET机理的Zn2+荧光探针基于PET和ICT荧光机制配位型金属离子探针的识别基团的差别？前者以非共轭键连接荧光团，后者直接连接在荧光团上。基于ICT机理的Zn2+荧光探针化学反应型ICT荧光探针基于ICT机理的ClO-荧光探针基于ICT机理的甲醛荧光探针基于ICT机理的ClO-荧光探针基于ICT机理的Pd0荧光探针基于ICT机理的GSH荧光探针基于ICT机理的GSH荧光探针常见用于设计ICT机制荧光探针的荧光染料有哪些？具有强推拉体系的荧光团，比如香豆素、萘、萘酰亚胺、苯并恶二唑、菲咪唑等。3,荧光共振能量转移(FRET,FluorescenceResonanceEnergyTransfer)荧光共振能量转移指一个荧光体系含有两个荧光团，一个充当能量供体(Donor,D)，另一个为能量受体(Acceptor,A)，当用供体D的激发去激发荧光体系时，可以发生从D到A的非辐射能量转移，从而发射出受体A荧光团的荧光。FRET发生所具备的条件：（1）能量供体荧光团D的荧光发射位于短波长处，且发射光谱和能量受体荧光团A的吸收光谱有一定重叠，能量受体能够在能量供体的发射波长处吸收能量；（2）能量供体与能量受体相隔的距离为10-100Å。FRETdonoracceptorR500550600Absorption(Acceptor)Absorption(Donor)Emission(Donor)NormaliedintensityNormaliedabsorptionWavelength,nmEmission(Acceptor)J能量传递效率：E=[(Fdonor−Fdonorincassette)/Fdonor]×100%FRET荧光机制示意图（3）供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似地平行。设计FRET荧光探针的策略：（1）通过调节能量受体A的摩尔吸光系数来改变其吸收光谱与能量供体发射光谱的重叠效率，以达到调控FRET；（2）通过调节能量受体A与能量供体D之间的距离来调控FRET；（3）通过调节能量受体A的吸收波长来改变其吸收光谱与能量供体发射光谱的重叠效率，以达到调控FRET；策略一：基于Coumarin-Rhodamine的FRET荧光探针第一代：基于FRET机理的Hg2+荧光探针第二代：基于FRET机理的Cu2+荧光探针第三代：基于FRET机理的Cu2+荧光探针基于其他以Rhodamine为能量受体的FRET荧光探针基于FITC-Rho平台的FRETpH探针基于Nap-Rho平台的FRETpH探针基于BOD-Rho平台的FRETAu3+探针基于DNS-Rho平台的FRETAu3+探针基于NT-Rho平台的FRETAu3+探针基于QNL-Rho平台的FRETAu3+探针以Fluorescein为能量受体的FRET荧光探针H2O2基于Cou-FITC平台的FRETH2O2探针基于BOD-FITC平台的FRETCys探针策略二：通过调节A-D距离的FRET荧光探针策略三：通过调节吸收波长的FRET荧光探针基于Cou-Nap平台的FRETH2S探针基于Cou-SBD平台的FRETCys探针基于FRET的荧光探针的特征？1，具有双荧光团；2，单激发波长和双发射带的比率信号；3，pseudo-Stokesshift较大。有哪些荧光团常用来设计FRET荧光探针的能量供体、受体？特殊情况：增强型FRET荧光探针！Turn-onFRET-basedCys探针当能量受体是一个无荧光的基团（Quencher）时，供体能量荧光被淬灭，探针无荧光；当能量受体被破坏/移除后，探针荧光恢复。4,共价键能量转移(TBET,Through-BondEnergyTransfer)TBET能量体系与FRET能量体系不同，不要求能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱有一定程度的重叠，它是能量供体与能量受体经过共轭键连接，将供体能量通过键直接传递到受体，但是能量供体与受体不共平面。在荧光光谱中体现为，激发能量供体，显示能量受体荧光发射峰。FRET和TBET荧光机制示意图TBET相比较于FRET的优势？1，能量供/受体的发射/吸收光谱无重叠要求；2，能量传递效率高。TBET-basedpH探针TBET-basedHg2+探针FRET-basedCu2+探针5,聚集诱导发光(AIE,Aggregation-inducedEmission)传统的荧光生色团在高浓度下荧光会减弱甚至不发光，这种现象被称作“浓度猝灭”效应，通常也被叫做聚集导致猝灭(ACQ,aggregation-causedquenching)。聚集诱导发光是指一类非平面的分子在其良溶液中不发光或发