第四章 蛋白质的性质、分类及研究方法

第四章蛋白质的性质分类及研究方法提纲一、蛋白质的理化性质二、蛋白质的研究方法三、蛋白质的分类蛋白质的理化性质紫外吸收：最大吸收峰为280nm两性解离：蛋白质的pI值不能直接计算，只能使用等电聚焦等方法进行测定胶体性质沉淀反应：盐析、pI沉淀、有机溶剂引起的沉淀和重金属盐作用造成的沉淀变性、复性水解颜色反应改变氨基酸残基侧链的离子化状态，从而影响蛋白质的电荷外布和氢键的稳定性。（十二烷基硫酸钠）能与蛋白质非极性侧链相互作用而破坏天然蛋白质的疏水相互作用。尿素和胍离子能与蛋白质内氢键基团形成更强的氢键高度水溶性，增大了非极性侧链在水中的溶解度破坏蛋白质分子内原有的疏水相互作用。变性因素变性原因pH的变化去垢剂离液试剂增大非极性物质在水中的溶解度，破坏蛋白质分子内部的疏水相互作用的能力蛋白质变性蛋白质受到某些理化因素的作用，其高级结构受到破坏、生物活性随之丧失的现象。导致蛋白质变性的物理因素有：加热、冷却、机械作用、流体压力和辐射；化学因素有强酸、强碱、高浓度盐、尿素、重金属盐、疏水分子和有机溶剂。蛋白质变性以后，其理化性质发生一系列的变化。这些变化可以作为检测蛋白质变性的指标。主要的变化包括：（1）溶解度降低。（2）黏度增加。（3）生物活性丧失。（4）更容易被水解。（5）结晶行为发生变化。蛋白质的水解蛋白质在强酸、强碱或蛋白酶的催化下均能够发生水解。但需要注意的是，酸水解会破坏几种氨基酸，特别是Trp几乎全部被破坏，其次是三种羟基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性条件下，容易水解成Glu和Asp；碱水解会导致多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，但不会破坏Trp；酶水解效率高、不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但不同的蛋白酶对肽键特异性不一样。四种羧肽酶来源和特异性几种蛋白酶特异性的比较蛋白质的各种颜色反应蛋白质研究方法假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X1.如何得到这种蛋白质?蛋白质的分离、纯化技术2.这种蛋白质的大小？（SDS-PAGE）3.它的pI是多少？（等电聚焦）4.其他细胞或其他生物体内是否存在？（Western印迹）5.其一级结构如何？（序列分析）6.其三维结构又如何？X-射线衍射和核磁共振蛋白质纯化准备工作要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。纯化步骤：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（5）鉴定蛋白质的分离与鉴定纯度蛋白质分离纯化步骤提取分离纯化鉴定组织匀浆、细胞破碎、盐析、离心、超滤凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析高效液相色谱－质谱双向电泳－质谱注意：保持生物活性分子大小溶解度电荷特异生物学亲和力高效液相层析——透析、超过滤、凝胶过滤——盐溶、盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀——离子交换层析、凝胶电泳——亲和层析常用蛋白质的分离纯化方法一、蛋白质的溶解性质与盐析分离1、胶体性质双电层水化层和双电层是蛋白溶液稳定的两个因素水化层水化层等电点条件时蛋白质净电荷接近零，溶解度最小！2、盐溶现象与盐析现象很低盐浓度————————盐浓度升高盐溶：在盐浓度很稀低范围内，随着盐浓度的增加，球状蛋白质的溶解度升高的现象。盐析：随着溶液中盐浓度升高，蛋白质的溶解度逐渐降低，蛋白质分子相互聚集发生沉淀的现象。？3、盐溶与盐析原理破坏电荷层，争夺水化层。（NH4）SO4溶解度大且随温度变化小，不易使蛋白质变性!增强水化层，降低蛋白质分子间的静电吸引。4、盐析——硫铵沉淀硫酸铵粉末或饱和硫酸铵溶液透析去盐类等小分子物质二、离子交换柱层析阳离子交换剂阴离子交换剂改变盐类离子强度和pH等电点大于7的蛋白质等电点小于7的蛋白质初始pH5.0初始pH8.0三、疏水层析蛋白质分子表面也存在一些疏水基团。疏水层析：利用蛋白质分子的疏水侧链与层析基质上的非极性基团之间的相互作用来分离纯化蛋白质。疏水层析：利用蛋白质分子的疏水侧链与层析基质上的非极性基团之间的相互作用来分离纯化蛋白质。洗脱方式：梯度降低水性缓冲液离子强度（疏水作用减弱）。洗脱液：通常为水性缓冲液。四、凝胶过滤层析分子排阻层析分子筛层析高度水化具不同大小孔径的网状结构的惰性多聚物颗粒。如：葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶。大分子小分子四、凝胶过滤层析——测定蛋白质的相对分子量A280五、亲和层析亲合层析：根据蛋白质的配体专一性建立的分离方法。配体：与某种蛋白质专一结合的分子。六、蛋白质电泳在pH9左右缓冲体系中，蛋白质组分具有净负电荷，在电场中向正极泳动，大小和净电荷相同的分子泳动速度相同，形成一个区带。制胶板电泳槽电泳仪聚丙烯酰胺凝胶1、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳——分离有生物活性蛋白质2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS：十二烷基硫酸钠，一种带负电荷的阴离子去污剂。获相同荷质比的SDS-蛋白复合体SDS破坏氢键和疏水作用，蛋白变性巯基乙醇破坏二硫键获得松散多肽链SDS所带负电荷覆盖蛋白所带电荷SDS-蛋白复合体均呈长椭圆棒聚丙烯酰胺凝胶凝胶的分子筛效应电泳结果只与多肽链分子量相关相对迁移率＝样品迁移率/染料迁移率3、双向电泳第一向：等电聚焦第二向：SDS-PAGE等电聚焦：根据样品中蛋白质组分的等电点的差异，通过电泳将它们分别聚焦在相应于它们各自等电点pH的凝胶部位。（凝胶经预电泳已建立均匀而连续的pH梯度）4、毛细管电泳（CE）5、电泳后的蛋白质检测考马斯亮蓝染色：根据考马斯亮蓝可与蛋白质多肽链定量结合的原理建立。活性染色：根据有活性的目标蛋白特有的生物化学反应产生的有色物质，或另外加入一种能与产物生成颜色的物质来进行检测。免疫印迹：根据一种蛋白质（抗原）能与它产生的抗体专一地反应。单克隆抗体（monoclonalantibody）以待测抗原（或抗体）和酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，然后通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）的含量。固定抗原加入多种特定抗体去除未能特异结合的抗体加入酶标抗体加入特异底物底物溶液变色反应免疫印迹测定（immunoblotassay）蛋白质样品凝胶电泳分离转移至硝酸纤维膜用同ELISA的方法处理只有含待测蛋白质的条带显色蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳蛋白质的双向电泳Western印迹蛋白质一级结构的测定直接测定法①化学测定法②质谱间接测定法。先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。蛋白质一级结构直接测定法的主要步骤多肽序列分析实例