6.酶分析技术剖析

本章内容概要：第一节酶活性测定的基本知识第二节酶活性测定方法及酶学分析的类型第三节同工酶测定第四节酶学分析在临床诊断上的应用第五节酶活性测定最适条件的选择1、掌握酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用；以NAD（P）H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用.本章教学要求：2、熟悉酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上的应用。3、了解Km值、Vmax值的应用及Km和Vmax的测定；同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择。第一节酶活性测定的基本知识酶活性的概念酶活性单位酶活性单位的计算酶促反应进程酶促反应底物动力学一、酶活性的概念酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为vv=-d〔S〕/dt或v=d〔P〕/dt。注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。二、酶活性单位定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。国际单位：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L。Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量，1Katal=60×106IU。三、酶活性单位的计算步骤：运用公式进行计算。明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，计算公式:产物的增加量每单位规定的保温时间1000（ml）酶单位/升=—————————×——————————×————————每单位规定的产物增加量实际保温时间实际标本用量（ml）分光光度法测定的公式：（A测定–A对照）·V总·106每单位规定的保温时间酶单位/升=—————————×————————·L·V标实际保温时间四、酶促反应进程酶促反应进程曲线酶量的测定：通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（〔E〕）与酶促反应速度成正比，即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。酶的含量酶活性酶促反应初速度五、酶促反应底物动力学中间产物学说：酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催化底物反应生成产物。E+SES→E+P米-曼氏方程：Vmax〔S〕v=—————〔S〕+Km上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度，〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。（一）米氏常数的定义由米-曼氏方程可以导出：（Vmax-v）〔S〕Km=———————v当v=1/2Vmax时，Km=〔S〕。因此Km值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重要的应用价值。（二）Km值的应用1.鉴定酶的种类Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其Km值加以鉴定。表7-1某些酶的Km值酶底物Km(mmol/L)乳酸脱氢酶丙酮酸0.017己糖激酶D-葡萄糖0.05D-果糖1.5-半乳糖苷酶D-乳糖4.0碳酸酐酶H2CO39.0过氧化氢酶H2O225蔗糖酶蔗糖28糜蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸1082.反映酶与底物的亲合力Km值越大，酶与底物亲合力越小，Km值越小，酶与底物亲合力越大。3.选择酶的最适底物Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时，不同底物有不同的Km值。酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶促反应容易进行，并节省底物用量。4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的比率根据米-曼氏方程可以计算5.设计适宜的底物浓度酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的90%～95%、底物消耗率为1%～5%。这样既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪费。(三)Vmax的应用定义：Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。应用：Vmax可用来计算酶的转化率（TN），即单位时间内每分子酶可使底物发生化学反应的分子数，单位为分子数/秒。当反应速度达到最大反应速度时，如果已知酶量，则可计算出酶的转化率：TN=底物转化量（mol/s）/酶量（mol）(四)Km和Vmax的测定1．Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法1Km+〔S〕Km11——=—————=———·——+———vVmax〔S〕Vmax〔S〕Vmax2．Cornish-Bowden作图法又称为直线线性作图法。第二节酶活性测定方法及酶学分析的类型酶活性的测定方法工具酶酶偶联测定法底物浓度测定一、酶活性的测定方法按照对酶促反应时间的选择不同连续监测法固定时间法（一）固定时间法分类：终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。两点法：该方法反应时间的预定是从t1～t2。定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。特点：优点是简单。缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30～60分钟为宜。（二）连续监测法原理：定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。该方法每隔一定时间（10s～60s）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。特点：在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法缺点：要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。优点:能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。二、工具酶定义：偶联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类分类：表7-2常用工具酶的名称及其缩写符号名称缩写符号名称缩写符号乳酸脱氢酶LDH苹果酸脱氢酶MDH6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PD谷氨酸脱氢酶GLDH葡萄糖氧化酶GOD胆固醇氧化酶COD磷酸甘油氧化酶GPO过氧化物酶POD己糖激酶HK肌酸激酶CK丙酮酸激酶PK甘油激酶GK脂蛋白脂肪酶LPL胆固醇酯酶CE脲酶肌酐酶三、酶偶联测定法应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应。ExEaEiABCP式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测定），Ex为待测酶，Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同，Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，CP称为指示反应。（一）酶偶联反应的原理在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定。（二）常用指示酶及其指示反应1．脱氢酶用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催化下列反应：P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。2．过氧化物酶POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：POD2H2O2+4-AAP+酚醌亚胺（红色）+4H2OTrinder反应：应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定。四、底物浓度测定利用酶催化反应的高效率和专一性，可以测定底物浓度。与酶活性测定类似。第三节同工酶测定同工酶的定义同工酶产生的机理同工酶的测定方法同工酶的定义是催化功能相同，但是分子组成及理化性质不同的一组酶，是在同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。一、同工酶产生的机理（一）由不同基因位点编码（二）由等位基因编码（三）由多肽链化学修饰产生二、同工酶的测定方法（一）按照理化性质不同进行分离鉴定1．电泳法同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。2．层析法根据同工酶分子荷电量不同，可用离子交换层析法加以分离。（二）按照底物专一性不同进行鉴定同工酶底物专一性不同，Km值也不同。如果同工酶之间的Km值差别足够大，可以通过测定其Km值加以鉴定。（三）按照最适pH不同进行鉴定同工酶分子氨基酸组成不同，最适pH也不同。如果同工酶最适pH之间的差别足够大，可以通过调节缓冲溶液的pH值加以鉴定。（四）按照免疫学特性不同进行分离鉴定（五）按照耐热程度不同进行鉴定（六）选择性抑制法第四节酶学分析在临床诊断上的应用血浆酶的来源酶的区域化分布酶活性测定在临床诊断中的应用同工酶的诊断价值一、血浆酶的来源血浆酶血浆特异酶非血浆特异酶外分泌酶细胞内酶二、酶的区域化分布表7-3诊断常用血清酶的来源血清酶符号来源鸟氨酸氨基甲酰转移酶OCT肝卵磷脂胆固醇酰基转移酶LCAT肝谷氨酸脱氢酶GLDH肝山梨醇脱氢酶SDH肝丙氨酸氨基转移酶ALT肝、肾、心异柠檬酸脱氢酶ICD肝、胎盘、心-谷氨酰转肽酶-GT肝、胆、肾、小肠5ˊ-核苷酸酶5ˊ-NT肝、胆道单胺氧化酶MAO肝、肾、脑天门冬氨酸氨基转移酶AST心、肝、骨骼肌肌酸激酶CK骨骼肌、心、脑乳酸脱氢酶LDH心、肾、骨骼肌、肝、肺碱性磷酸酶ALP小肠、胎盘、肝、肾酸性磷酸酶ACP前列腺、红细胞、血小板淀粉酶AMS胰、唾液腺脂肪酶LPS胰三、酶活性测定在临床诊断中的应用（一）在肝脏疾病诊断中的应用（二）在急性心肌梗死诊断中的应用（三）在急性胰腺炎诊断中的应用（四）在骨骼疾病诊断中的应用（五）在肌肉疾病诊断中的应用（六）在前列腺疾病诊断中的应用（七）在肿瘤诊断中的应用四、同工酶的诊断价值第五节酶活性测定最适条件的选择（一）标本（二）测定条件底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助因子、激活剂和抑制剂