补肾排毒合剂对瘦素神经内分泌轴的影响

补肾排毒合剂对慢性肾衰竭大鼠瘦素—神经内分泌轴的影响青岛市中医医院于俊生研究的目的和意义近年来,瘦素（Leptin）、瘦素受体及神经肽Y（NPY）与慢性肾功能衰竭营养不良的关系引起了国内外学者的普遍关注，本实验运用免疫组化方法，观察了补肾排毒合剂对慢性肾衰竭营养不良大鼠Leptin及NPY代谢的影响，旨在探讨补肾排毒合剂治疗慢性肾衰竭营养不良的机理。研究方法实验试剂SABC免疫组化试剂盒瘦素兔抗人多克隆抗体、瘦素受体兔抗人多克隆抗体（Ob-Ra、Ob-Rb通用），NPY兔抗人多克隆抗体（由博士德生物工程有限公司提供）实验药品补肾排毒合剂：由柴胡、黄芩、太子参、生地、大黄、六月雪等药物经水煎熬汁、浓缩而成。生药含量为2.71g/ml。由青岛市中医医院制剂室提供。实验动物Wistar大鼠60只，雌雄各30只，体重240-280g，由青岛市动物研究所提供。于室温23℃，用标准大鼠饲料分笼喂养，自由饮水。相同条件喂养1周后随机分为3组：正常对照组（Ⅰ组）15例、慢性肾功能衰竭组（Ⅱ组）22例、慢性肾功能衰竭灌胃组（Ⅲ组）23例。建立动物模型正常对照组行假手术。慢性肾衰组：采用两步部分肾切除法，首先梯形切去左肾两极，四周后行右肾全切。慢性肾衰灌胃组：两步部分肾切除法同肾衰组，术后六周模型成熟开始予补肾排毒合剂灌胃，持续6周。标本收集与病理切片三组大鼠均于术后12周行脱颈椎处死，取头背部“丁”字型切开皮肤，去掉颅骨，取出整个脑组织，沿矢状面切开，保存。刨开腹腔，取出脂肪组织和左肾组织。取出组织用10%甲醛固定；清水洗涤，逐级酒精脱水；然后浸蜡，石蜡包埋，制作3μm厚的连续切片。免疫组化（SABC法）58℃烤片过夜，梯度乙醇脱蜡至水。滴加3%H2O2，湿盒内室温放置20min，单蒸水洗。滴加复合消化液，37℃放置1小时，0.01MPBS洗。滴加血清封闭液，置于湿盒内，室温放置20min，甩去多余液体。滴加适当稀释的一抗，置于湿盒内，4℃过夜。0.01MPBS。滴加生物素化羊抗兔IgG，置于湿盒中，37℃放置20min。滴加试剂SABC，37℃，20min，0.01MPBS洗次。DAB显色，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。结果判定每组切片随机选取5个区域，每个区域包含100个同类细胞，计量阳性细胞，取平均数作为每张切片的阳性细胞数。统计学方法计量资料结果表示为均数±标准差，先采用方差齐性检验，再用两两t检验，用Excel统计软件处理，p0.05差异有统计学意义。结果Leptin在脂肪组织的表达数目镜下阳性细胞数P1P2Ⅰ组1535.73±14.89Ⅱ组2061.70±22.960.002Ⅲ组2249.45±13.600.0280.080P1：与Ⅰ组比较，P2：Ⅱ组与Ⅲ组比较Ob-R在肾脏的表达数目镜下阳性细胞数P1P2Ⅰ组1568.40±23.38Ⅱ组2035.45±18.450.001Ⅲ组2250.59±19.260.0390.047P1：与Ⅰ组比较，P2：Ⅱ组与Ⅲ组比较Ob-R在下丘脑的表达数目镜下阳性细胞数P1P2Ⅰ组1514.73±7.55Ⅱ组2033.65±14.150.001Ⅲ组2223.86±11.200.0290.048P1：与Ⅰ组比较，P2：Ⅱ组与Ⅲ组比较NPY在下丘脑的表达数目镜下阳性细胞数P1P2Ⅰ组1529.33±15.07Ⅱ组2012.70±6.910.001Ⅲ组2219.13±7.730.0250.045P1：与Ⅰ组比较，P2：Ⅱ组与Ⅲ组比较讨论瘦素与瘦素--神经内分泌轴Leptin主要在脂肪和胎盘组织合成，是由167个氨基酸组成的一种分泌型蛋白质。Leptin通过其受体作用于不同组织，发挥生物学效应，受体中作用明确而且最重要的是长型受体（Rb）和短型受体（Ra）。肾脏是清除Leptin的重要器官。瘦素-神经内分泌轴：Leptin与Ra结合通过血脑屏障，在下丘脑与Rb结合，通过双向激活激酶（JAK）或信号传导和转录激活蛋白（STAT）途径进行信号传导，影响神经肽Y(NPY)等多种神经内分泌激素的分泌，调节食欲及机体能量消耗，改变营养状态。瘦素--神经内分泌轴与CRF营养不良实验结果显示CRF大鼠Leptin-神经内分泌轴存在明显异常。脂肪组织Leptin表达增高，肾脏Ob-R表达降低，使Leptin的排出减少，造成高瘦素血症。中枢Ob-R活性增强，Leptin通过血脑屏障向下丘脑转运的量增加。相对较多的Leptin进入下丘脑，通过表达增强的Rb，抑制了NPY的分泌。大鼠食物摄入减少，体重降低，进而逐渐出现营养不良。补肾排毒合剂对瘦素--神经内分泌轴的影响用药组Leptin在脂肪组织较肾衰组表达略有减少。肾组织中Ob-R表达较肾衰组增强。脑中Ob-R的表达强度较肾衰组减弱，NPY的表达增强。补肾排毒合剂使肾脏对leptin的降解排出增多。同时调整机体细胞代谢，改善胃动力，饮食增加，反馈性抑制leptin受体活性。随着脑中Ob-R的表达强度减弱，进入脑组织leptin的量及其对NPY的抑制作用减轻，NPY的合成分泌增加，使食欲增强，蛋白、脂质合成增加，从而改善CRF大鼠的营养状态。