免疫组化技术

免疫组化技术北京神经科学研究所免疫组织化学（immunohistochemistry)又称免疫细胞化学（immunocytochemistry)是组织化学的分支，它是应用带有可见标记的特异性抗原-抗体反映，在原位检测组织和细胞的化学成分的一种技术。在基础研究领域应用：生物活性肽，酶和免疫球蛋白。临床应用：肿瘤的诊断和分型；自身免疫性疾病的检查，寄生虫等检测一基本概念二免疫学基础抗原(antigen)：凡能刺激机体发生特异性免疫应答的物质。抗原的两个基本性能：（1）免疫原性：是指抗原刺激机体产生抗体或效应淋巴细胞的性能，从而引起体液免疫和细胞免疫。（2）免疫反应性：是指抗原与抗体或效应淋巴细胞发生特异性结合能力。完全抗原：既有免疫原性也有免疫反应性的抗原半抗原：或称不完全抗原，仅有免疫反应性的抗原(多糖，类脂多肽等）抗原性质：异物性，理化特性，特异性（抗原决定簇）抗体（AntibodyAb)：抗体是机体在抗原激活后，由B细胞分化的浆细胞产生的一类能与相应抗原结合的免疫球蛋白（immunoglobulin)共有IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五种。基本结构：IgM分子结构抗体的种类：有多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体Polyclonalantibody：用含多种抗原决定基的抗原免疫动物，刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原决定基的不同抗体，为多克隆抗体，其免疫血清是含有多种抗体的混合物。特异性不高，易出现交叉反应单克隆抗体Monoclonalantibody：由一个B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞及其后代产生的一种高度均一、高度专一性的抗体，它只对一个抗原决定基发生反应，称单克隆抗体，其特异性强。三常用标记物1荧光染料：可以产生荧光的染料物质。其可吸收激发光的光能并发射出荧光。特点：A荧光色素具有吸收一定频率光能的生色团和能产生一定光量子的荧光团。B荧光素与抗原或抗体结合后，不破坏抗原、抗体的免疫活性，制备成荧光标记的抗原或抗体与组织内的抗体或抗原结合形成不同颜色的激发荧光。C荧光存在的时间短，易猝灭，不利于观察和分析。种类1异硫氰酸荧光素（FITC):为黄色粉末或结晶，性质稳定，易溶于水和酒精。低温可保存多年，呈黄绿色荧光（490-495nm；520-530nm）2四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC):为紫色粉末，易溶于水。呈橙红色荧光（550nm，620nm）；3CY3(552nm,565nm2酶：酶是最常用的标记物，可用于光镜和电镜观察。酶作为标记物应具备的条件:1）酶催化的底物必须具有特异性，容易显示（2）酶的性质稳定，不易扩散。（3）被检组织内不应存在内源性的酶或者其底物，若有应加酶的抑制剂，抑制内源性的酶（4）在酶标记过程中，酶与抗体连接不能影响二者的活性。常用的标记酶：辣根过氧化物酶（houseeradishperoxidaseHRP)硷性磷酸酶（alkalinephosphataseAKP)葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase)半乳糖苷酶（β–D-galactosidase)酶底物PH，温度有色产物过氧化物酶：底物是H2O2反应产生初级复合物，有电子供体存在时，产生还原型酶，释放氧，将电子供体氧化，产生有色终产物HRPH2O2电子供体（DAB）PH=7.6，温度37°C有色产物有色产物硷性磷酸酶（AKP)：AKP使底物为萘酚磷酸盐中萘酚衍生物释放，并与固蓝（或者固红）结合形成兰色（红色）偶氮染料AKP萘酚磷酸盐固蓝BBPH=9.1，温度37°C兰色产物3生物素（biotin)：为水溶性维生素H，分子量小，通过其羧基与蛋白质的氨基结合,从而标记抗体和酶等，在肝肾、白细胞和蛋黄中含量丰富，是羧化酶和脱羧酶的辅酶，生物氧化的重要介质。特点：A与抗生物素之间以非共价键结合，作用快有极强的亲和力，结合牢固，一但结合很难解离。B抗体与生物素结合后抗原的活性不受损失。抗生物素(avidin)：又称亲和素、卵白素，是鸡鸟等动物的输卵管分泌的一种碱性糖蛋白，蛋清含量丰富。抗生物素有4个亚单位。特点：A与4个生物素残基特异性结合，有极高的亲和力（1.5PH情况下解离）。B能与标记物结合。4金属标记物：主要有铁蛋白和胶体金，用于免疫电镜。组织制备常用的试剂配制1.常用缓冲液：ATris(三羟甲基氨基甲烷）缓冲液和Tris缓冲盐液（TB和TBS）B磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐液（PB和PBS）C醋酸缓冲液D0.1mol/l柠檬酸缓冲液2常用固定液：4%多聚甲醛0.1mol/lPB,PH:7.43黏附剂；A明胶铬矾液（明胶：0.5g，铬矾0.05g加100ml水）B多聚赖氨酸4蛋白酶消化液：0.1%trypsin(可加氯化钙）：注意消化时间0.4%胃蛋白酶5H2O26去污剂tritonx-100浓度为0.1%-2.0%,溶于PBS7蔗糖溶液5%-30%溶于PB或PBS。8DAB:9封固剂A甘油缓冲液（荧光染色）B永久封固剂，树胶等（DAB）四染色方法免疫组织化学染色方法的类型1、直接法：用抗原免疫动物制备的抗血清，称特异性抗体即第一抗体。将标记物与一抗结合。反应：组织的抗原+带标记物的一抗在组织原位形成可视的沉淀物抗原抗体复合物+检测标记物（1）二抗制备：用产生第一抗体动物的血清免疫另一种属动物，获得的血清称第二抗体。（2）反应：组织抗原+一抗+标记二抗+检测2间接法：第一抗体未标记，而第二抗体以荧光素、酶或胶体金等标记3未标记抗体酶法：所用抗体均未标记，利用第二抗体作为桥将第一抗体和终抗体连接起来，而终抗体作为抗酶抗体，产生于第一抗体来源相同的动物种属。由于所用抗体未标记，避免了共价结合，较好的保护了抗体和酶的活性，敏感性增加。目前常用的未标记抗体酶法是用桥抗体将第一抗体和标记的检测试剂复合物连接起来。包括：过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）复合物；硷性磷酸酶-抗硷性磷酸酶（APAAP）复合物；抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶（ABC）复合物等ABC法原理：将抗生物素蛋白与生物素标记的过氧化物酶按一定的比例混合制成ABC复合物，使抗生物素蛋白分子上的3个生物素结合位点被生物素标记的酶所占据，空下一个结合位点。第一抗体处理组织切片后，加上生物素标记的第二抗体，其中第二抗体与第一抗体通过抗原抗体反应结合，而生物素则与第三层ABC复合物的抗生物素蛋白空下的位点结合。1）石蜡切片脱蜡到水或者冰冻切片。2）0.3%H2O2（溶于水，缓冲液）15-20min，封闭内源性过氧化物酶或内源性生物素。3)抗原修复：3）TBS洗2次，每次5-10min4）0.2-1%TritonX-10030min5)3-10%二抗动物的正常血清30min,37oC，不洗入下一步6)滴加适当稀释的一抗，4oC过夜或37oC12h。7)TBS洗3次，每次5-10min8)生物素标记的二抗。1-2h,37oC9)TBS洗3次，每次5-10min10)滴加ABC复合物。37oC下1-2hour11)TBS洗3次，每次5-10min12)滴加酶底物，如标记HRP,用DAB-H2O2和AEC;如标记AKP,用萘酚AS-BI等。13)0.05TB洗脱水透明封片。对照片应用PBS代替一抗，其他步骤相同ABC法染色步骤优点：敏感性强，比PAP高2040倍。特异性强，减少了非特异性染色，故背景染色淡。方法简便注意事项：ABC试剂的存储和配置：不能混用，新鲜配置，4C保存。溶液的PH值设立对照实验（阳性实验和阴性实验）DAB显色的原理HRP在分解H2O2过程中，与H2O2形成初级复合物，若无电子供体，反应不再进行。当DAB电子供体存在时迅速形成中间产物和水，酶被还原、聚合、再经氧化环化，最终形成苯乙肼聚合体呈棕黄色沉淀。背景染色的来源和消除方法：1）固定不够或者不适当：使细胞内抗原转移到细胞外，2）染色过程中切片干燥。用湿盒，注意抗体的干燥等3）内源性酶活性---过氧化物酶，在一、二抗前处理4）内源性抗生物素蛋白结合部位的阻滞：某些组织和细胞含有生物素的酶类，内源性抗生物素蛋白结合活性较常见，造成背景染色。在一抗前用0.01%抗生物素蛋白20minTBS洗；0.01%生物素20min5）游离醛基：以醛类固定的组织如果在染色前没有彻底冲洗，则可能存在游离的醛基与抗体发生非特异性结合。处理方法为正常血清封闭游离醛基。DAB特点：A形成的颜色永久保存不褪色。B不溶于有机溶剂，可以脱水透明。C终产物有嗜锇性，经OsO4固定电子密度高，适于电镜观察。D有毒和致癌性，使用时注意防护6）抗体与FC受体结合组织含有免疫球蛋白的受体，造成非抗原部位的结合。处理方法为：用产生的第二抗体的动物的正常血清来封闭7）抗体不纯应用高效价的抗体8）清洗彻底9）交叉反应性较难处理，尽量用单克隆抗体增强特异性染色的方法：1）增加抗体孵育时间：高倍稀释抗体的情况2）重复抗体或检测试剂次数（第一抗体或第二抗体，稀释倍数要增加）3）蛋白酶消化，使抗原决定簇去遮蔽4）增加抗体的穿透能力5）增加DAB反应产物的着色：A锇化：DAB显色以后以0.01-1%OSO4(溶于TBS、PBS30秒）棕黑色B镍加强法：DAB-H2O210ml显色液加50ul8%NiCl2-----紫兰色C钴镍加强法：100mgDAB溶于200ml0.1mol/lPB,逐滴加入5ml1%氯化钴，然后再加入4ml1%硫酸镍铵10-15min----反应为黑色。免疫组化TH神经元DAB染色如果处理不当会产生很强的背景染色五免疫荧光组织化学技术1、染色法的种类及原理：（1）直接法：将组织的抗原+荧光标记的特异性抗体（一抗）直接进行免疫反应，在荧光显微镜下观察。优点：方法简单，特异性高。适于细菌、真菌、螺旋体等的检测。2）间接法：组织抗原+一抗+荧光素标记的二抗，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。优点敏感性高，应用广泛可用于双标染色方法：1）石蜡切片脱蜡到水或者冰冻切片PBS洗10分钟。2）0.2-1%TritonX-10030min3)3-10%二抗动物的正常血清30min,37oC，不洗入下一步4)滴加适当稀释的一抗，4oC过夜或37oC12h。5)TBS洗3次，每次5-10min6)荧光标记的二抗。1-2h,37oC7)TBS洗3次，每次5-10min8）甘油封固，荧光显微镜或共聚焦显微镜观察注意事项：加入荧光抗体后要避光；注意反应时间甲醛固定要注意自发荧光CY3免疫荧光染色CY3免疫荧光染色FITC荧光染色免疫荧光双重染色一抗种属来源不同：可以一抗同时加或者分步加均可，二抗种属来源可以相同也可以不同，分别用不同的荧光标记，如FITC和TRITC（或者CY3，CY5）一抗种属来源相同：可以分布加如下a一抗a二抗b二抗b一抗甲醛蒸汽法甲醛蒸汽法：1升容器加3g多聚甲醛，封闭容器，80C烤1-4小时免疫荧光双标染色BrdUandNeuN荧光染色注意假性双标:荧光染色注意假性双标:1:串色2:细胞重叠