聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 步骤 详细

李莉聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE上海交通大学医学院小结1.掌握（不连续）PAGE的原理2.掌握影响PAGE迁移率的因素3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用4.熟悉PAG的聚合上海交通大学医学院思考题名词解释1.凝胶总浓度2.交联度问答题1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。2.试比较CAME与PAGE操作的区别。3.简述不连续PAGE的原理。上海交通大学医学院讲课内容PAG的组成1PAG的聚合2PAG的浓度与孔径的关系3不连续PAGE4PAGE的特点5上海交通大学医学院一、PAG的组成PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylenebisacrylamide，Bis）交联剂通过自由基（freeradicals）聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr+Bis-----porousmatrix上海交通大学医学院（1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式上海交通大学医学院（2）亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylenebisacrylamide，Bis）上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容PAG的组成1PAG的聚合2PAG的浓度与孔径的关系3不连续PAGE4PAGE的特点5上海交通大学医学院二、PAG的聚合polymerizationofPAG需要催化剂(catalyzer)——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基(Freeradicals)，从而与Bis进行聚合上海交通大学医学院（一）化学聚合：AP-TEMED系统过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（-N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine,TEMED）为加速剂。上海交通大学医学院AP在水溶液中能产生游离基SO42-.，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-.注意：TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合上海交通大学医学院（二）光聚合：核黄素-TEMED系统有痕迹氧存在下，核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。上海交通大学医学院讲课内容PAG的组成1PAG的聚合2PAG的浓度与孔径的关系3不连续PAGE4PAGE的特点5上海交通大学医学院三、PAG的浓度与孔径的关系theinitialconcentrationsofacrylamideandBIScontrolthehardnessanddegreeofcrosslinkingofthegel.PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种物质的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr/Bis：20~40完全透明且有弹性＜10很脆，易碎，不透明＞100糊状不成形，易破碎上海交通大学医学院凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。T=（a+b）/m×100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。上海交通大学医学院交联度C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）×100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。上海交通大学医学院讲课内容PAG的组成1PAG的聚合2PAG的浓度与孔径的关系3不连续PAGE4PAGE的特点5上海交通大学医学院四、不连续PAGE(DiscontinuousPAGE)按具体操作分垂直板形电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分continuousPAGEdiscontinuousPAGE上海交通大学医学院Schematicofdiscontinouselectrophoresistechnique上海交通大学医学院Disc-PAGE成分作用样品胶T=3%C=20%单体欲分离的样品溶液pH6.7Tris-HCl缓冲液混在一起，用光聚合方法聚合而成的大孔凝胶有防对流作用电极槽缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液上海交通大学医学院Disc-PAGE成分作用浓缩胶除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同样品在此胶中被浓缩上海交通大学医学院Disc-PAGE成分作用分离胶T=7%C=2.5%单体溶液pH8.9Tris-HCl缓冲液化学聚合法聚合成小孔胶主要的电泳分离部分上海交通大学医学院分离原理1.浓缩效应1）凝胶层的不连续性两层凝胶T与C不同孔径不同浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。上海交通大学医学院2）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。上海交通大学医学院pH8.3Tris-Glycinebuffer甘氨酸HCl蛋白质样品胶浓缩胶分离胶样品低电导区上海交通大学医学院3）pH值的不连续性为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。上海交通大学医学院3.分子筛效应与电荷效应进入分离胶后，Gly-成为快离子分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院Loadasampleintoapolyacrylamidegelelectrophoresiswell上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容PAG的组成1PAG的聚合2PAG的浓度与孔径的关系3不连续PAGE4PAGE的特点5上海交通大学医学院五、PAGE的特点1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节上海交通大学医学院小结1.掌握（不连续）PAGE的原理2.掌握影响PAGE迁移率的因素3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用4.熟悉PAG的聚合上海交通大学医学院思考题名词解释1.凝胶总浓度2.交联度问答题1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。2.试比较CAME与PAGE操作的区别。3.简述不连续PAGE的原理。