预处理技术

第三章预处理技术刘耀玺河南科技大学林业职业学院生物技术教研室第一节概述一、预处理的概念:就是从生物材料出发，设法使所制备的目标产物转移到溶液中，同时去除其他悬浮颗粒（如培养基残渣、菌体、细胞或絮凝体等）以及改善溶液的性状，以利于后续各步操作的过程。是生物物质分离纯化的第一个必须步骤。二、预处理的目的1、改变发酵液（培养液）的物理性质，以利于固液分离。主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂等。2、去除发酵液（培养液）中部分杂质以利于后续各步操作。第一节概述三、生物材料的预处理过程1、动物组织和器官要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，然后绞碎，选择适当的溶剂形成细胞悬液。2、植物组织和器官要先去壳、除脂，再粉碎，选择适当的溶剂形成细胞悬液。3、发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及制成的细胞悬液等根据目标产物所处位置不同进行相应的处理。第一节概述动物细胞培养的产物大多分泌在细胞外培养液中。微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等。分泌在细胞外的产物称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。许多基因工程产品都是胞内产物。植物细胞产物多为胞内物质。第一节概述注意：有些生物物质在发酵结束时部分会沉积或被吸附在菌体中，应采取措施尽可能使其转移到液相中，通常采用调节pH至酸性或碱性的方法来达到。例如四环类抗生素，由于其能与钙、镁等离子形成不溶解的化合物，故大部分沉积在菌丝中，用草酸酸化后就能转入水相，再经固一液分离除去细胞（菌体）。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化微生物发酵液的特性可归纳为：1、发酵产物浓度较低，悬浮液中大部分是水；2、悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；3、固体粒子可压缩性大；4、液体黏度大，大多为非牛顿型流体；5、性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响；6、成分复杂，杂质较多。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化一、改变发酵液过滤特性的方法1．降低液体黏度（加热处理）升高温度可有效降低液体黏度，提高过滤速率，同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。加热处理应注意：1、加热的温度必须控制在不影响目的产物活性变质的范围内；2、温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化2．调整pH利用酸性来调节发酵液pH使之达到等电点，可除去蛋白质等酸性物质。在膜液过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化3．加入反应剂原理：（1）加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体黏结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙沉淀可充当助滤剂，（2）可使某些蛋白质凝固。又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固，多余的磷酸根离子还能除去钙离子、镁离子，并且在发酵液中不会引入其他阳离子，以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。（3）一些酶的分解作用。例如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025％的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5％硅藻土助滤剂，可使过滤速率提高5倍。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化4、使用惰性助滤剂助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。原理:充当过滤介质的助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持良好的渗透性，既能使悬浮液中细小颗粒状胶态物质截留在格子骨架上，又能使清液有流畅的通道。所以使用惰性助滤剂能大大提高过滤能力和生产效率，改善滤液澄清度，降低过滤成本。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。助滤剂的使用方法有两种：①在过滤前先在过滤介质表面预涂（铺）一层助滤剂。②助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中。也可两种方法同时兼用。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化助滤剂的选择要点（1）粒度选择（2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂的品种（应针对不同的发酵液和过滤要求，通过过滤实验，优选最佳的助滤剂。）（3）用量选择（一般在助滤剂用量等于进料中固体含量时，滤速最快。）不足之处：粒度微细的助滤剂会降低滤液澄清度，另外某些抗生素还会与硅藻土产生不可逆的结合。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化三、发酵液的相对纯化1、去除杂蛋白质的其它方法（1）．等电点沉淀（2）．变性沉淀使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、在碱性溶液中加入一些阳离子（如重金属离子如Ag＋、Cu2＋、Pb2＋等、在酸性溶液中加入一些阴离子（如有机酸盐：三氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等）及表面活性剂。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化（3）．吸附在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。如四环素生产中，蚕蛹黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀来吸附蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，形成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去，从而加快了过滤速度。第二节发酵液过滤特性的改变与相对纯化2、不溶性多糖的去除3、高价金属离子的去除对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等高价金属离子，预处理中应将它们除去。(1)去除钙离子，常采用草酸钠或草酸。(2)镁离子的去除也可用草酸，但草酸镁溶解度较大，故沉淀不完全，也可采用磷酸盐，使生成磷酸钙盐和磷酸镁盐沉淀而除去。(3)除去铁离子，可采用黄血盐，形成普鲁士兰沉淀第三节凝聚和絮凝凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液（或培养液），改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。第三节凝聚和絮凝一、凝聚定义：是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。原理：发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒子（即正离子）被吸附在其周围，在其界面上形成了双电子层。这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。双电层的电位越高，电排斥作用越强，胶体粒子的分散程度也就越大，发酵液过滤就越困难。凝聚作用向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。第三节凝聚和絮凝第三节凝聚和絮凝电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L)称为凝聚值。电解质中反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg3+＞K+＞Na+Li+工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂有：硫酸铝[Al2（SO4）3·18H2O]（明矾）、氯化铝AlCl3·6H2O、氯化铁(FeCl3)、ZnSO4、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O)、MgCO3等；常用的金属氧化物类凝聚剂有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等。第三节凝聚和絮凝二、絮凝定义：絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质）在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。优势：1、提高固一液分离速度，分离菌体、细胞和细胞碎片等；2、能有效除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。第三节凝聚和絮凝絮凝的原理：絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，可以带有多价电荷（如阴离子或阳离子），也可以不带电性（如非离子型）。它们通过静电引力、范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上产生架桥连接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。如果胶粒相互间的排斥电位不太高，只要高分子聚合物的链节足够长，跨越的距离超过颗粒间的有效排斥距离，也能把多个胶粒拉在一起，导致架桥絮凝。第三节凝聚和絮凝第三节凝聚和絮凝常用的絮凝剂是人工合成的高分子聚合物和天然有机高分子物质。人工合成的高分子聚合物分为有机高分子聚合物和无机高分子聚合物。有机高分子聚合物有聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物，根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子性（含有胺基）三类。由于聚丙烯酰胺类凝聚剂具有用量少，絮凝体粗大、分离效果好、絮凝速度快以及种类多等特点，所以适用范围广。它们的主要缺点是有一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，一般不宜用于食品和医药工业。第三节凝聚和絮凝近年来还发展了聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（如聚氧化乙烯、聚丙烯酸钠）和聚苯乙烯类衍生物（如聚苯乙烯磺酸等），无度，应用较多。无机高分子聚合物（如聚合铝盐和聚合铁盐等）也是较好的一类絮凝剂。天然有机高分子絮凝剂常见的有：壳聚糖和葡聚糖等聚糖类、明胶、骨胶、海藻酸钠、微生物絮凝剂等。天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，具有安全、无毒和不污染环境等优点，发展较快。注意：对于带负电性的菌体和蛋白质来说，阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥的双重作用，所以可以单独使用。第三节凝聚和絮凝对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥，它们常与无机电解质絮凝剂搭配使用。混凝的定义：首先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂。无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥作用创造了良好的条件，从而提高了絮凝效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。第三节凝聚和絮凝影响絮凝效果的因素①絮凝效果与发酵液的性状有关，如细胞浓度、表面电荷的种类和大小等，故对于不同特性的发酵液应选择不同种类的絮凝剂；②对于一定的发酵液，絮凝效果还与絮凝剂的用量、分子量和类型，溶液的pH，搅拌速度和时间等因素有关。ⅰ)絮凝剂用量（适宜的添加量通常由试验得出，因为料液中絮凝剂浓度的增加有助于架桥充分，但过量时反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象。）第三节凝聚和絮凝ⅱ)分子量和类型（虽然高分子絮凝剂分子量提高、链增长，可使架桥效果明显，但分子量不能超过一定的限度，因为随分子量的提高，高分子絮凝剂的水溶性降低，因此，分子量应选择适当。）ⅲ)溶液的pH（可以适当提高溶液的pH。因为溶液pH值的变化常会影响离子型絮凝剂中功能基团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子集团间的静电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。）第三节凝聚和絮凝ⅳ)搅拌速度和时间（加入絮凝剂的初期应高速搅拌，使絮凝剂快速均匀分散到料液中，不形成局部过浓，但接着应低速搅拌，有利于絮凝体长大成团，如仍高速搅拌易将絮凝团打碎，影响絮凝效果，所以应采