作物应答盐碱胁迫的分子调控机理

项目名称：作物应答盐碱胁迫的分子调控机理首席科学家：郭岩中国农业大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：教育部一、关键科学问题及研究内容拟解决的关键科学问题：在前期973项目研究的基础上，本项目以水稻、玉米和拟南芥为材料，拟解决的主要科学问题是：作物重要耐盐碱基因的克隆，植物盐碱胁迫信号感受和重要调控单元的鉴定、作用机制分析以及作物耐盐碱品种培育的分子设计。我们将针对我国不同地区的盐土、碱土和苏打盐土的特殊性、围绕植物响应盐碱胁迫的信号感受-信号转导和基因转录调控两个网络交叉互作的重要节点进行重点研究、并根据得到的重要节点组成的调控单元（Regulatorymodule），通过“智能型”转化系统进行初步耐盐碱作物的分子设计。这些问题的解决，不仅对解析植物耐盐碱机理和阐明植物适应其它非生物逆境的机理有重要的理论意义，同时对耐盐碱作物分子设计育种和耐盐碱作物新品种培育以及我国盐碱土地的开发利用具有重要的应用前景。主要研究内容：在前期973项目顺利实施的基础上，根据作物应答盐碱胁迫的“信号感受—转导—蛋白修饰—染色质修饰/转录调控—离子平衡/细胞活性—反馈互作及网络调控”的基本过程和研究思路，围绕植物响应盐碱胁迫的信号转导和基因转录调控两个网络的交叉互作调控，寻找负责调控植物盐碱胁迫反应的两个网络的重要节点以及由包括这个（或这些）重要节点组成的重要调控单元，重点探讨植物对盐碱胁迫的感知、染色质修饰与盐碱胁迫反应关键基因转录活性调控和植物耐盐碱的关系。使我们能够比较系统和深入地了解植物对盐碱胁迫反应的分子机制，并为通过分子设计培育耐盐碱作物（玉米、水稻）新品种提供理论基础和遗传材料。通过创造（人工诱变、渗入系等）主要农作物耐盐碱材料和寻找地方品种耐盐碱资源，分离、克隆耐盐碱基因或QTL，明确它们在抗逆调控途径中的位置，初步阐明其耐盐碱的分子调控机理，为作物品种改良提供有利的抗逆新基因。项目拟研究的主要内容包括：1）作物感应高盐胁迫的分子机制；2）作物应答盐碱胁迫的重要功能基因/QTL的克隆和转录调控、组蛋白修饰调控机理；3）作物对盐碱胁迫的下游反应：植物生长发育、细胞离子平衡和活性的调控机理；4）作物应答盐碱胁迫的信号感受、转导、蛋白修饰、基因转录及代谢调控的分子网络交互作用节点和调控单元模型的建立与完善，以此为基础通过‘智能’转化系统初步尝试耐盐碱作物（玉米、水稻、小麦）分子设计。二、预期目标总体目标：阐明对改良作物耐盐碱抗逆性状有重要作用、可用于我国作物抗逆新品种培育的重要基因/节点和这些重要基因构成的调控单元；提出我国作物耐盐碱性状改良分子育种的新设计方案，为我国利用分子设计育种方法培育作物抗逆新品种并最终为保障我国的粮食安全作出贡献；阐明数个在植物响应盐碱逆境胁迫的信号感受、转导、基因转录调控及细胞活性调控研究领域的重要科学问题，发表在国际科学界有影响的高水平研究论文；培养一批能够独立从事相关领域高水平研究的优秀年轻人才，组织和形成一支具有团结协作精神的植物抗逆分子机理研究队伍、并保持和巩固团队在这一领域的领先水平。五年预期目标:通过项目实施，获得几个由信号转导网络和基因转录调控网络交叉互作的重要基因/节点组成的整合盐碱信号和反应的调控单元，并针对调控单元初步尝试耐盐碱作物分子设计；克隆30个以上对植/作物耐盐碱有重要功能或调控作用的新基因并完成对其功能的解析，并使其中的一些成为培育耐盐碱品种的分子标记；建立和完善23个植物应答盐碱胁迫的信号转导和基因表达分子调控网络途径，完成对其中关键调控因子的详尽分析；在国际学术期刊发表研究论文100篇以上（或论文累计SCI影响因子400以上）；获得20个以上对改良作物抗逆性状有应用价值的新基因发明专利。初步尝试主要农作物（水稻、小麦和玉米）耐盐碱性状改良的分子育种技术设计，并获得35个耐盐碱作物新品系等。培养具有博士和硕士学位的优秀年轻人才100人、博士后30人，使其中部分优秀年轻人才具有独立从事相关领域高水平研究的综合能力。三、研究方案1）学术思路：根据项目拟解决的关键科学问题和主要研究内容，本项目整体上分为植物应答盐碱胁迫的“信号感受、转导、蛋白修饰和转录调控、细胞活性调控”分子机制四个层次的研究：鉴定、克隆农作物的重要耐盐碱基因/QTL，为作物耐盐碱育种提供分子标记，通过对植物响应盐碱胁迫的信号感受、信号转导网络和基因转录调控网络交叉互作的重要节点的重点分析研究，找出参与植物盐碱胁迫反应的调控单元，并根据得到的重要节点调控单元通过“智能型”转化系统进行初步耐盐碱作物的分子设计，最终为我国耐盐碱作物新品种培育和粮食安全做出贡献。2）技术途径：项目拟解决的主要科学问题是：重要农作物耐盐碱基因/节点和植物盐碱胁迫反应重要调控单元的鉴定、作用机制分析和作物耐盐碱分子设计。为了解决上述科学问题，以遗传学、细胞生物学、生物化学和分子生物学、基因组学等技术和方法，研究以下四个主要内容并通过对这些问题研究结果的分析和整合来鉴定节点和调控单元、分析调控单元的作用机制：1.植物感受和响应盐碱胁迫的信号转导分子调控机理；2．植物响应盐碱胁迫的组蛋白修饰和基因转录调控；3．盐碱胁迫下植物细胞离子平衡和活性的调节；4．分离、克隆主要农作物耐盐碱基因/QTL，根据信号转导网络和基因转录调控网络交叉互作的重要节点鉴定调控单元并进行耐盐碱作物分子设计。通过详细研究和分析植物盐碱胁迫反应的信号转导网络和转录调控网络的整合来寻找植物耐盐碱的重要节点，筛选鉴定植物整合盐碱信号和反应的调控单元并把调控单元作为整体进行作物分子设计。整体研究方案有利于系统、全面地探讨植物应答盐碱胁迫的分子调控机理，也有助于逐步阐明植物应答逆境胁迫的信号感受、转导、转录和翻译后调控、代谢调控等之间的复杂网络机制。理论上对阐明应答盐碱胁迫的分子机制有重要作用；同时可能为提出作物耐盐碱性状改良的分子育种设计新方案提供理论基础。四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1.对拟南芥的盐驯以及感受盐信号的机理进行研究，筛选相关参与盐驯过程的基因；分析SNR受体激酶的活性在高盐胁迫中所起的负调节作用SNR与氧化胁迫的关系；PLC、DGK，LPP单、多重突变体鉴定；磷脂酶和微管的关系，PA-MAPs研究；建立蛙卵和HEK293细胞系表达通道（载体蛋白）、电生理检测技术；筛选SCaBP8、SCaBP1、PKS5结合蛋白；筛选影响植物耐盐性的小分子活性化合物；ROP家族及其下游效应子RIC家族各相关突变体及转基因株系盐碱表型分析；2.盐胁迫条件下DNA甲基化调节的目标基因分离与DNA甲基化水平检测；DNA甲基化和盐胁迫响应突变体的筛选；盐诱导植物全基因组水平组蛋白甲基化变化检测；筛选MKK9介入的MAPK级联系统磷酸化的转录因子并克隆基因；两类转录因子（PHD和Trihelix家族）参与的盐碱应答功能分析；elf1突变体盐反应表型分析；3.水稻突变体Osakt1高盐条件下的表型观察，构建过表达材料所需载体和转化材料；进行OsSKIPa与SIP5和SIP25的互作鉴定，相关基因突变体鉴定和遗传转化分析；分离相关突变体和产生LPAAT2、LPPa5和CDS的RNAi及过表达材料；对已获得的参与盐胁迫反应的S6K1的突变体和过表达材料进行分析；构建分离群体，初步定位水稻耐盐相关基因或QTL；选择受转录因子1.初步阐明盐驯以及植物感受盐信号的生理学机制，克隆与盐驯、感受盐信号相关的候选基因；初步确定磷脂和微管互作在耐盐信号转导中的作用；得到2-4个SCaBP8、SCaBP1、PKS5结合蛋白；确定存在影响植物耐盐碱性的内源小分子化合物；获得盐相关钙信号突变体；获得1-2个参与盐碱应答的ROP家族或RIC家族的成员；2.得到盐诱导植物全基因组水平组蛋白H3K4甲基化变化数据；分离受DNA甲基化调节的目标基因2-3个；分离DNA甲基化和盐胁迫响应突变体3-5个；得到候选MAPK途径转录因子基因；得到PHD和Trihelix突变体并进行表型分析；完成elf1突变体盐反应表型分析；3.明确水稻Osakt1在高盐条件下的盐敏感表型；获得SIP5、SIP25基因突变体和过表达表型；获得LPPa5、LPAAT2和CDS基因的突变体和超表达植株；初步探明PA-S6K1在盐胁迫下调控植物生长和细胞活性的作用；定位1-2个水稻耐盐基因或QTL；获得1-2个水稻相关新基因的转基因植株；完成qRGE4-2和qSTL2-1的精细定位，获得2－3个芽期和苗期盐胁迫候选；4.获得2-3个聚合多个重要耐盐调控基因的转基因植物；证实TaSRO1是否拥有PARP酶活性，以及通过PARP酶活增强基因组稳定性；证实TaSRO1通过何种途径调控ROS平衡；建立水稻、玉年度研究内容预期目标DST调控的下游基因构建各种表达载体，进行转化水稻；采用染色体片段迭代法，精细定位野生稻芽期盐敏感QTLqRGE4-2和苗期耐盐QTLqSTL2-1筛选野生稻盐胁迫候选基因；4.以玉米、草坪草、苜蓿品种为受体材料，对多基因表达载体NCED3-ABAR-DREB1A-LOS5-ICE和SOS1-SOS2-SOS3-SCaBP8等进行多基因的遗传转化；建立XVE诱导表达系统，实现在特异性启动子驱动下的多基因表达；测定TaSRO1重组蛋白的PARP活性，分析PARP与基因组稳定性的关系；利用获得的转EAR类抑制子基因水稻材料鉴定其耐盐性；完善建立水稻、玉米、草坪草、苜蓿适时、适地、高效的智能转化系统；在宁夏银北地区选取具有不同盐碱类型的试验地（西大滩、银北农垦暖泉农场）对获得的水稻、玉米、草坪草和苜蓿耐盐碱材料进行分子选育和定向改造。米、草坪草、苜蓿适时、适地、高效智能转化系统；筛选鉴定耐盐碱较强的水稻特异材料8-12个；5.5.发表SCI论文8-10篇，申请专利2-4项。第二年1.筛选盐驯相关的突变体，观察突变体植株对盐驯和感受盐信号的表型；分析盐驯以及感受盐信号相关基因的生化特性；分析SNR的激酶区关键的磷酸化基团及其在盐胁迫信号传递或耐盐胁迫中的作用；进一步研究PLC，DGK，LPP，PLD在耐盐响应中的作用；观察候选ROP-RIC信号途径中重要成员的突变体及转基因株系中细胞骨架组织动态的变化；SCaBP8、SCaBP1、PKS5结合蛋白的相关基因突变体的鉴定和盐碱表型的分析；小分子活性化合物的鉴定；2.盐胁迫条件下目标基因启动子在转基因后代中DNA甲基化水平1.获得1-2个与盐驯和感受盐信号相关的新基因，完成生化特性分析；鉴定磷脂酸（PA）调控的微管结合蛋白1个；基本探明PLC，DGK，LPP，PLD在PA产生中的贡献和耐盐作用；获得有盐碱表型的SCaBP8、SCaBP1、PKS5结合蛋白的基因突变体；初步确定小分子活性化合物的结构；阐明ROP-RIC信号途径调控细胞骨架动态变化的作用机理；确定SNR的激酶区关键的磷酸化基团及其在盐胁迫信号传递或耐盐胁迫中的作用；2.分离盐胁迫响应的miRNAs3-5个；鉴定miRNA靶基因2-3个；了解PHD和Trihelix家族参与的年度研究内容预期目标分析；部分目标基因超表达和RNAi植株或T-DNA插入突变体的耐盐性分析比较；两类转录因子（PHD和Trihelix家族）参与的盐碱应答机制分析；拟南芥和玉米中盐胁迫响应的miRNAs的分离；构建大豆4-5个、水稻3-4个候选基因表达载体，转化拟南芥/水稻/大豆，观察转基因植物根系的表型；ELF1调节植物盐胁迫反应的分子机制分析；3.对水稻OsAKT1进行转基因功能互补实验，构建标签基因共表达载体转化植株；利用DST调控的下游基因的转基因株系进行抗逆相关生理功能分析；OsSKIPa互作蛋白SIP5和SIP25基因功能分析；深入分析S6K1应答盐胁迫反应中的作用及其调控机理；分析LPAAT2、LPPa5和CDS对植物应答盐胁迫中的脂质代谢和膜脂组分的影响；分离克隆水稻耐盐相关基因/QTL；构建野生稻盐胁迫侯选基因的基因组功能互补载体、RNAi载体、过量表达载体、和GUS、GFP基因的共表达载体，并进行遗传转化；