OMEGA-Gel-Extraction-Kit操作流程

OMEGAGelExtractionKit操作流程(此流程只供各位学习参考)1、进行琼脂糖凝胶/溴化乙锭电泳，分开不同的DNA片段。可以使用不同种类或级别的琼脂糖，但是强烈建议使用新鲜的TAE或TBE电泳缓冲液。重复使用电泳缓冲液，其pH值会升高，从而减少DNA回收产率。2、当电泳条带分开后，使用一个宽、净、锋利的手术刀小心．．切除目的条带。尽可能的去除不含目的片段的胶，使胶条尽可能的小。3、将胶条放入干净的1.5ml的微量离心管中进行称重，以确定胶条的体积。假设胶的密度是1g/ml，其体积可以按如下得出：胶条的质量是0.3g，则其体积是0.3ml。加入等体积的结合缓冲液/BindingBuffer(XP2)。将混合物在50℃~55℃孵育7分钟或直至凝胶完全溶化，期间需每隔2~3分钟摇动或涡旋离心管。注意：胶完全溶解后，观测混合液的pH，如果pH值超过8.0，DNA的回收率将会大打折扣。具体操作为：若混合液的颜色变为橙色或红色（pH变大），加入5μl5M的醋酸钠/pH5.2，降低其pH值。调整后混合液的颜色应该变为浅黄色。4、将离心柱/DNAMiniColumn装在标配的2ml收集管/CollectionTube内。5、将700μl混合液加入到离心柱内，室温10,000xg离心1min。6、弃去离心液，将离心柱装在刚才用过的收集管内。如果溶液体积大于700μl，则以每次700μl的量依次装配离心柱、离心。每个离心柱的DNA总产量是25μg。如果期望产量大于25μg的上限，将样品分装入合适数量的离心柱内。7、加入300μl结合缓冲液/BindingBuffer(XP2)到离心柱内，室温10,000xg离心1min以冲洗离心柱。弃去离心液，重复利用收集管。8、加入700μl已用无水乙醇稀释的SPW清洗液/SPWWashBuffer冲洗离心柱。室温10,000xg离心1min。注意：SPW清洗浓缩液使用前必须用无水乙醇稀释（按每25ml清洗浓缩液加入100ml无水乙醇的比例稀释）。如SPW清洗液经过冷藏，使用前必须恢复至室温。9、可选（建议使用）：用另外的700μlSPW冲洗液重复第8步操作。注意：此后的任何操作流程如对盐敏感，执行二次清洗操作。10、弃去离心液，将空离心柱全速（≥13,000xg）离心2min，甩干离心柱的基质。去除离心柱内的乙醇非常关键，切不可遗漏此步骤。11、将离心柱置于一个干净的1.5ml微量离心管内。将15~30μl（取决于终产物的期望浓度）洗脱液/ElutionBuffer直接加入到离心柱基质上，室温孵育1min。全速（≥13,000xg）离心1min洗脱DNA。这样可获得大约70%的DNA。可选择进行二次洗脱，以获得残留的DNA（浓度较低）。注意：离心柱内洗脱DNA的效率取决于洗脱液的pH值，如果使用去离子水洗脱DNA，请确保pH值在8.0左右。12、DNA的回收产量和品质：测定适当稀释的样品在260mn和280nm的吸光度。DNA的浓度计算如下：DNA浓度=A260×50×稀释倍数μg/ml。长度大于500bp的片段通常纯化率大于80%。50~500bp的片段一般为55%~80%。A260/A280的比率反应核酸的纯度，比值大于1.8表明核酸纯度＞90%。另外，产量和质量有时可由琼脂糖凝胶/溴化乙锭电泳是否新鲜（pH）来决定。