第10章外源基因表达与基因工程药物

第10章外源基因表达与基因工程药物基因表达：利用细胞内相关酶系统及其调控系统，将外源基因转录成mRNA，进而翻译成肽链或加工成活性蛋白质的过程，称之为基因的表达（表达）。基因表达：转录和翻译两个阶段。外源基因表达转录有两种模式：原核和真核翻译有两种模式：原核和真核基因表达两种表达类型：原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。实现外源基因表达外源基因表达：利用分子生物学技术，在体外将目的基因导入宿主细胞内，借助宿主细胞进行表达。实现外源基因的表达技术主要有两项：基因工程技术转基因技术：转基因植物和转基因动物。从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因工程也称为重组DNA技术。严格地说，DNA重组技术并不完全等于基因工程。重组DNA技术诞生的理论基础：①遗传物质基础的证明：40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；②DNA双螺旋结构和功能的阐明：50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；③遗传信息的流向和表达机制的阐明：50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。基因工程诞生的标志1972年，斯坦福大学，P.Berg小组，世界首例DNA体外重组。SV40/EcoRⅠ+λDNA/EcoRⅠ↓recombinantDNA1973年，斯坦福大学，S.Cohen小组，体外重组并转化成功。R6-5（KanR）/EcoRⅠ+pSC101（TetR）/EcoRⅠ↓recombinantDNA↓转化菌（双抗）基因工程的诞生（一九七三年）综合S.Cohen和P.Berg创造性的研究成果，“在细胞外，把目的核酸分子与载体核酸分子组合成新的遗传物质，再把它导入原本没有这种物质的细胞内，并使这种重组遗传物质在细胞内的无性繁殖获得成功”，这一工作内容定义为基础工程，世界上第一次完成这项工作内容的1973年被公认为基因工程诞生的元年。乳腺生物反应器荷兰生产促红细胞生成素的转基因牛年产值40亿美元英国生产-胰蛋白酶制剂的转基因羊一杯羊奶6000美元将不同的生物基因在体外剪切，组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，引入原先没有这类基因的受体细胞内进行扩增，使转入的基因在细胞内高效表达，并合成该基因所编码产物。基因工程概念（掌握）基因工程可以分为上游技术和下游技术两大部分。上游技术指重组DNA技术/分子克隆技术/基因克隆技术下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接重组3.重组DNA分子导入宿主细胞4.重组子的筛选与确认5.目的基因表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物基因工程技术的基本步骤重组DNA技术的四大要素①外源基因；②工具酶；③载体；④受体细胞。一目的基因的获得化学合成利用RT-PCR扩增目的基因利用PCR扩增目的基因各种杂交技术基因文库的构建及目的基因分离二目的基因与表达载体的重组载体工具酶（一）主要载体系统载体：凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以供插入或克隆目的基因DNA并具有传递运载外源DNA导入宿主细胞能力的片段统称为载体。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。载体的基本条件1、能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制。2、具有合适的多种限制酶的单一切点，可插入一段较大的外源DNA，而不影响其本身的复制；3、具有适宜的筛选标记。例如抗药性标记，蓝白斑试验；根据质粒载体的用途进行分类克隆载体(cloningvector)指使插入的外源DNA序列被扩增为目的，用于基因克隆，并不需要得到目的基因所编码蛋白质的载体。表达载体(expressionvector)能使外源目的基因在宿主细胞中转录和表达的功能性载体。1.质粒克隆载体质粒—染色体外能自主复制的共价双链闭合环状DNA分子，广泛存在于原核细胞内。2、质粒DNA分子的构型●共价闭合环型DNA（cccDNA），SC构型●开环DNA（ocDNA），OC构型●线性DNA（ss-CDNA），LC构型电泳迁移率：SCDNALDNAOCDNA质粒载体的一般结构pBR322质粒载体目前基因克隆中广泛使用的pBR322质粒，是按设想构建的一种大肠杆菌质粒载体，有万能质粒之称。常见的大肠杆菌质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSE2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点。pUC18和pUC19载体pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ‘基因2.表达载体(expressingvector)特点：在克隆载体的基础上，携带转录和翻译所需的DNA序列，即转录翻译调控系统的起始、终止序列等。如：启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子转录终止序列翻译起始区：核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)，起始密码子(ATG)和SD序列3.噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒的总称。其结构比质粒要复杂，噬菌体的DNA除了复制起点以外，还有编码外壳蛋白质的基因。用作克隆载体的噬菌体有：λ噬菌体，M13噬菌体。λ噬菌体载体λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体，是迄今为止研究得最清楚得一种大肠杆菌双链DNA噬菌体。λDNA为线状双链分子，长度为48502bp，已经定位得λ噬菌体的基因至少有61个，其中一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，称这类基因为λ噬菌体的必要基因。另一部分基因则被称为非必需基因，被外源基因取代后不影响生命周期。基因工程载体的构建去除不良基因。如致病基因等必需区内的不必要的限制性内切酶位点的改变。在非必需区构建需要的内切酶位点。鉴定系统。所谓柯斯质粒，乃是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒载体pHC79，就是由λDNA片段和pBR322质粒DNA联合组成的。4.病毒载体为适应真核细胞重组DNA技术需要，特别是为满足真核基因表达和基因治疗的需要，发展了一系列动植物病毒DNA改造的载体，如SV40（猿猴病毒）载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等。酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）5.其他所谓穿梭载体是一类既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中表达复制的载体。（二）工具酶1.DNA限制性内切酶2.DNA连接酶●1.核酸内切限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切水解酶。EcoRIHindIII第一个字母取自产生该酶的属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名EcoRI属种株序EscherichiacoliRY13大肠埃希菌RY13株中发现的第一种限制新核酸内切酶2、类型：Ⅱ型核酸限制性内切酶（1）识别序列及切割位点特征：通常是4～8个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’常用限制性内切酶种类及特性（2）切割后产生的末端粘性末端平末端5’末端突出的粘性末端3’末端突出的粘性末端5ˊ粘性末端如EcoRⅠ切割后产生5ˊ粘性末端：3ˊ粘性末端如PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端：EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’平末端（3）同裂酶与同尾酶同裂酶：来源不同但识别和切割同样的核苷酸序列的限制性酶。同尾酶：来源、识别顺序和切割方式均不同，所生成的限制性片段却是相同粘性末端。5’……G|CGG……3’3’……GGC|G……5’HpaⅡMspⅠ同裂酶：来源不同但识别和切割同样的核苷酸序列的限制性酶。BamHI5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BglII5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’同尾酶同尾酶：来源、识别顺序和切割方式均不同，所生成的限制性片段却是相同粘性末端。●DNA连接酶——基因工程的缝纫针功能：将两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组。作用：催化形成3′-5′磷酸二酯键1、大肠杆菌DNA连接酶连接粘性末端的DNA片段，不能连接DNA平末端2、T4DNA连接酶连接粘性末端的DNA片段，也能连接DNA平末端DNA连接酶的种类：宿主菌或受体细胞大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞三、导入重组体主要方法转化（作用）（transformation）转导（作用）（transfection）电转化法（electrotransfortion）(电穿孔术electroporation)微注射技术（microinjection）基因枪技术（geneblastertechnique）脂质体介导法（liposomemediatedgenetransfer）重组DNA分子导入大肠杆菌2.转化：以质粒DNA或以它为载体构建重组质粒DNA导入细胞，而使细胞的遗传学发生改变的过程。1.转导：将温和的噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子，体外包装成具有感染性的病毒颗粒直接导入受体细胞中的过程。用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。1、制备感受态细胞2、DNA分子转化感受态细胞Ca2+诱导大肠杆菌转化法/氯化钙转化法感受态细胞：为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态被称作感受态细胞（competentcells）。制备感受态细胞Ca2+与细菌细胞膜磷脂层在低温（0℃）下形成液晶结构，后者经热刺激（42℃）发生收缩作用，使细胞膜出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。Ca2+诱导大肠杆菌转化法/氯化钙转化法1、制备感受态细胞2、DNA分子转化感受态细胞大肠杆菌载体0℃CaCl2选择性培养基上培养筛选阳性克隆得到大量目的基因CaCl2法选择性培养基上培养3.电转化法在高压电脉冲作用下在细胞膜上形成微小疏水孔洞。促使细胞吸收介质中的DNA进入细胞质。用途广泛，植物、动物细胞。4.重组DNA分子导入植物细胞●农杆菌介导的Ti质粒载体转化法叶盘转化法根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌。能感染植物受伤部位，诱发植物产生冠瘿瘤。根癌农杆菌细胞中含有Ti质粒。在Ti质粒上有一段T-DNA，即转移-DNA(transfer-DNA)。根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，根癌农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。土壤农杆菌转化植物细胞：含外源基因的Ti质粒转化到土壤农杆菌取植物组织叶片，在培养基上生长，感染已转化的农杆菌诱导生根发芽，获得转基因植株5、其他方法●显微注射技术●磷酸钙转染法●基因枪技术基因枪法：使用高能微粒子轰击将DNA导入培胞或活的哺乳动物组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将这些微弹加强速到很的速度轰击细胞。显微注射法：在显微镜下，将DNA用玻璃显微注射器直接注射入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作技巧脂质体载体法：类脂经机械搅拌、超声波等处理，形成双脂层小囊泡，将外源DNA包装在脂质体的内部，在融合剂如PEG