病原微生物检查

病原微生物检查Exerciseten制作者：黄海婵（[e-mail]）Tel:[phone]or0571-88320057•目的要求•实验材料•实验程序•实验报告•思考题细菌学检查目的要求•了解大肠菌群作卫生指标原因及检测原理、菌种鉴定原理。•正确测定食品中细菌总数和大肠菌群数，会从EMB平板上区分大肠菌群。•了解食品中和食物中毒样品中沙门氏菌的检验•菌落总数：指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。判定样品被污染程度的标志•大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN)表示。•沙门氏菌属（Salmonella）:是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门氏杆菌。•1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属。此菌可引起禽伤寒、鸡白痢、猪霍乱、鼠伤寒沙门氏菌、猪副伤寒、马流产沙门氏菌等疾病。•致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)。实验材料•样品：水样、饮料、药物、鸡蛋、乳类等•培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基伊红美兰培养基（EMB平板）单倍乳糖蛋白胨培养基6支/每组双倍乳糖蛋白胨培养基3支/每组100ml氯化镁孔雀绿增菌液DHL平板•其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、记号笔、接种环、试管架、酒精灯、火柴、标签纸、实验程序•Ⅰ：样品中细菌总数检查•Ⅱ:样品中大肠菌群的检测•Ⅲ：样品中沙门氏菌的检验实验程序Ⅰ——样品中细菌总数检查检样做成几个适当倍数的稀释液选择2~3个稀释度，各以1mL分别加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂菌落计数报告实验程序Ⅱ——样品中大肠菌群的检测德汉氏小管发酵培养基：含蛋白胨、溴甲酚紫和糖产酸使培养基变黄产酸使培养基变黄德汉氏小管中有气体证明产气EMB平板上的大肠杆菌典型菌落实验程序Ⅲ——食品中沙门氏菌的检验检样增菌培养选择性平板分离纯化生化试验血清学技术提供了培养物菌种的鉴定实验报告•（一）、增菌培养•冻肉、蛋品，乳品及其它加工食品首先需要进行前增菌。•1、取样25g(m1)，加入225ml缓冲蛋白胨水中。固体食品可先用均质器以8000～10000转／分打碎1分钟，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌匙或玻璃棒研磨使其乳化。•2、36+1℃培养4小时，移取10ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18～24小时。同时，另取10ml，加入于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1℃培养18～24小时。•鲜肉，鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌，各取25g(m1)加入灭菌生理盐水25ml按上述方法做成匀浆，取其半量接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18～24小时；另一半量接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1℃培养18—24小时。•（二）、分离培养•用铂金耳取一环增菌液分别划线接种于：•亚硫酸铋琼脂平板(BS)和DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、SS琼脂平板)各一个，于36+1℃分别培养18—24小时(DHL、HE、SS)或40—48小时(BS)。观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌属亚属工、Ⅱ、Ⅳ、V和Ⅲ型在各个平板上的菌落特征见表5-4。•（三）、生化试验•挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。在三糖铁琼脂内，各菌属的主要反应结果如表5—5。•表5—5说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸同时H2S阴性的菌株可排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时均有不是沙门氏菌的可能，都需要作进一步的生化试验，必要时作涂片染色镜检(沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌)。•接种三糖铁琼脂的同时，还要接种蛋白胨水，pH7.2尿素琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36+1℃培养18～24小时，必要时可延长至48小时，按表5-6判定结果。沙门氏菌的结果应属于Al、A2和Bl，其他五种反应结果均可以排除。•反应序号Al，典型反应判定为沙门氏菌属。如果尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常，按表5-7仍可判定为沙门氏菌，如有两项异常，则按A3判定为枸橼酸杆菌。•（四）、血清学分型鉴定（了解，试验略）•用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O血清及H因子进行玻片凝集试验。•1、抗原的准备•2、O抗原的鉴定•用A—F多价O血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株；不能分型。•3、H抗原的鉴定•4、Vi抗原的鉴定•（五）、菌型的判定和结果报告•综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照常见沙门氏菌抗原表及其补充表判定菌型。并报告结果。•1.菌落总数的计数方法（1）计算相同稀释度的平均菌落数有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数×2（2）选择平均菌落数在30～300之间的平板只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数。有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。（3）所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数。（4）所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数。（5）所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。实验结果及报告2.大肠菌群测定的结果观察挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。紫红色，具有金属光泽的菌落。深红色，不带或略带金属光泽的菌落淡红色，中心色较深的菌落。•凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。•将10、1、0.1mL样品的发酵管结果查表，得每升样品中的大肠菌群数3.沙门氏菌检验的结果观察观察DHL平板上生长的菌落，挑取可疑菌落接种三糖铁琼脂，记录反应结果，看三糖铁琼脂斜面是否为红色，底部是否变黑并产气4.根据以上所检测的结果，判断样品的污染状况。思考题•1、你所测的样品污秽程度如何？•2、大肠菌群的定义是什么？•3、EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠杆菌的时候，各起什么作用？•4、硫代硫酸钠在自来水取样中起什么作用？湖水取样中是否也需用到？•5、DHL平板培养基和三糖铁琼脂内含有哪几种主要成分？各其什么作用？本次实验课结束请保持台面干净！请值日同学留下下周将进行结果观察和考试再见！