PCR原理及其操作

PCR反应原理及其操作1.PCR的基本原理2.PCR反应体系3.PCR的基本步骤4.PCR反应五要素5.PCR的反应流程PCR的基本原理•试管中进行的DNA复制反应，依据①DNA半保留复制的机理；②体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；•通过人为控制体外合成系统的温度，使①双链DNA变成单链，②单链DNA与人工合成的引物退火，③DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR反应体系•4种dNTP混合物各200umol/L•引物各10～100pmol•模板DNA0.1～2ug•TaqDNA聚合酶2.5u•Mg2+1.5mmol/LPCR的基本步骤72℃94℃55℃PCR循环PCR的基本步骤•1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。•2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。•3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）PCR的基本步骤1234522557294时间（min）温度（℃）低温退火2高温变性1适温延伸3重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA变性形成2条单链DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍高温变性低温退火中温延伸PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。PCR扩增曲线PCR反应五要素•1.引物（primer）•2.酶（TaqDNApolymerase）•3.dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）•4.模板（template）•5.Mg2+（magnesium）1.引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计的原则①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右；②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；⑧引物量：每条引物的浓度0.1~0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会2.酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应：–天然酶：从栖热水生杆菌中提纯–基因工程酶：大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100µl时）；浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3.dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系：–dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活–dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解–在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量–dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低4.模板（靶基因targetgene）模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一；传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本；–SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；–蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增；RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA5.Mg2+浓度•Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响;•在一般的PCR反应中，各种NTP浓度为200µmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜;•Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR的反应流程1.温度与时间的设置2.循环次数1、温度与时间的设置•设置变性-退火-延伸三个温度点•标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃退火，然后快速升温至70～75℃延伸，•对于较短靶基因（长度100～300bp）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸。①变性温度与时间：•一般93℃～94℃，1min足以使模板变性–若低于93℃则需延长时间–但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。②退火(复性)温度与时间：•退火温度是影响PCR特异性的重要因素•退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度•对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想•Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T)•复性温度=Tm值－（5～10℃）–在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性•复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：③延伸温度与时间：•延伸温度：一般选择在70～75℃之间–常用温度为72℃–过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。•延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定–1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）–3～4kb的靶序列需3～4min–扩增10kb需延伸至15min•延伸时间过长会导致非特异性扩增•对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些2、循环次数•循环次数–决定PCR扩增程度•循环次数–主要取决于模板DNA的浓度•循环次数：选在30～40次之间•循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多