第八章 催化水解反应的金属酶分析

第八章•第一节概述•第二节羧肽酶•第三节碳酸酐酶根据酶催化反应的类型，把酶分为六类：氧化还原酶类催化氧化还原反应转移酶类催化功能基团转移反应裂解酶类催化从底物移去一个基团而留下双键的反应或其逆反应异构酶类催化异构体互相转变合成酶类催化双分子合成一种新物质同时使ATP分解的反应水解酶类催化水解反应第一节概述•一、水解酶六大酶类之中研究的最多并应用最广泛的一类，其中有不少水解酶的活性与金属离子有关。后页表中列出若干水解金属酶和金属离子激活酶。金属离子激活酶是指必须加入金属离子才具有活性的酶。水解酶根据水解键的类型不同分为六个亚类。•酯酶作用于酯键，使其水解为酸和醇•糖苷酶作用于糖基化合物，使糖键水解•醚酶作用于醚键，使其水解•肽酶作用于肽键，使其水解•C-N酶作用于其它C-N键•酸酐酶作用于酸酐本章仅对肽酶及酯酶作一些介绍肽酶催化蛋白质的肽键水解蛋白质为高分子物质，不能透过细胞膜，必须水解成小分子才能被肠吸收。蛋白质由各种肽酶催化，水解成小分子，被肠吸收。肽酶肽链端解酶肽链内切酶（蛋白酶）氨肽酶羧肽酶嗜热菌蛋白酶•根据作用方式，肽酶又分为肽链端解酶和肽链内切酶。肽链端解酶从肽链羧基末端和氨基末端切下氨基酸，前者称羧肽酶，后者称氨肽酶。•内切酶是另一类肽酶，用于切断蛋白质分子内部肽键使之变成小分子多肽，如嗜热菌蛋白酶。酯酶催化酯键水解，其中羧酸酯酶催化羧酸酯水解RCOO—R’+H2O→RCOOH+R’OH磷酸酯酶催化磷酸酯键水解OO‖‖RO―P―OR’+H2O→RO―P―OH+R’OH||OHOHR=H时，磷酸单酯酶（如：碱性磷酸酯酶）磷酸二酯酶（如：磷脂酶C)•水解金属酶之中很多都与Zn2+有关。•其次：Ca2+、Mg2+，还有少数酶含Mn2+•由于水解过程不发生电子转移，所以金属离子的氧化态在催化过程中不变化。二、水解金属酶研究中的过渡金属离子•EPR、Mössbauer、d-d电子光谱－金属酶存在某种过渡金属。•Zn2+,Ca2+,Mg2+等离子不具有未充满的d轨道，因此含有Zn2+,Ca2+,Mg2+等离子的金属酶就难以应用上述检测技术获得有用信息。•为了深入研究金属酶的性质，通常采用探针。一般采用Co2+代替Zn2+，用Mn2+代替Mg2+。非过渡金属Tl+作为K+的NMR探针。•使用探针离子遵循的原则：同晶置换，即探针离子在酶分子中占据原有金属离子所在的同一位置。•电子构型、离子半径、配位几何构型。•很关键问题：是否能继续保持酶分子的生物活性。•金属配位键的强弱对于决定反应的途径也很重要，而这种配位键的强度可随金属不同而变化。•Zn2+的电子结构：d10，在可见区没有吸收。在羧肽酶研究中采用Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Rh3+，Cd2+，Pd2+等离子取代。•Co2+取代的羧肽酶A对肽键的水解具有很强的活性。•Co2+羧肽酶A的吸收光谱与经典的四面体配位的钴配合物很不同，而且摩尔消光系数很大，这是由于金属处在畸变四面体配位引起的；圆二色谱、磁圆二色谱和低温EPR谱的结果证实这一点。•证明锌酶中的Zn2+处于畸变四面体配位状态。•碳酸酐酶研究中，钴酶活性是锌酶活性的50%，而Ni2+，Mn2+，Fe2+酶仅稍具活性，其它惰性。•Co2+取代酶大都能在不同程度上保持酶的催化活性。•电子结构、离子半径、配位几何构型。•Co2+配合物有多种几何构型，高自旋Co(II)配合物优先采取四面体结构。•四面体场中，高自旋Co2+的电子组态为e4t23，相当于Zn2+的d10组态的球对称结构。•采用Co2+作为探针，就能提供锌酶的金属结合部位结构的有用信息。第二节羧肽酶•羧肽酶是催化肽链的C-末端氨基酸残基水解的酶。第一个被发现的锌酶第一个被发现的金属酶动力学、结构、光谱最清楚的水解酶•羧肽酶分类：金属酶，存在于胰液中，细胞外酶，帮助蛋白质消化，中性或弱碱性显示极大的活性非金属酶（酵母羧肽酶C），细胞内酶，在酸性条件下具有很大活性。一、羧肽酶A•1.组成、结构与功能•（1）组成：存在哺乳动物胰脏中，相对分子质量34600，Zn2+作为辅基，单一多肽链，约300个氨基酸残基。•研究比较多的是牛的羧肽酶A。羧肽酶原A在胰蛋白酶作用下，一个肽键断裂，释放出大约60个氨基酸残基的N-末端裂解物。在不同条件下，可以产生4种不同羧肽酶A：α307;β305;γ300;δ300动物体内羧肽酶原A二聚体或三聚体，无活性胰蛋白酶激活60个氨基酸残基-N末端裂解物肽键断裂α,β,γ,δ四种不同的羧肽酶307，305，300，300通常说的羧肽酶A就是羧肽酶Aα•(2)结构：椭球形，羧肽酶A(α)大约一半的氨基酸形成α-螺旋结构或β-折叠结构。•其余氨基酸无确定模式，相对容易变形，与底物结合相联系的构象变化主要在这些容易变形的部分发生。•酶分子中部一狭长的空腔，底物结合位置。•底物的C－末端沿这条沟槽伸入到酶分子内的活性部位，空腔中还有一定数量的水分子，Zn2+就处于这条空腔的内表面，它是维持羧肽酶A活性所必须的组分。Zn2+与多肽链的两个组氨酸（69,196）的咪唑基氮原子，以及谷氨酸（72）的羧基氧原子以配位键结合，Zn2+第４配位为水。Zn2+处于畸变四面体配位状态中。•〔3〕功能：•催化蛋白质或多肽的羧基末端肽键的水解反应。除了脯氨酸之外，羧肽酶能不同程度的催化具有各种C-末端氨基酸的肽链水解。•底物的C-末端侧链为芳基或分支较大的脂基羧肽酶显示出很强的活性。―NH―CH―CO―NH―CH―COO-+H2O→||R2R1―NH―CH―COOH+NH2―CH―COO-||R2R12.肽水解的催化机理•（1）活性部位•早期的蛋白链化学修饰法已经确定羧肽酶的活性部位。•Zn2+除与组氨酸（His-69)、-196，以及Glu-72形成直接参与催化作用的活性部位外，还包括Arg-145，Tyr-248和Glu-270，它们的侧联基团也是直接与底物结合的部位。•当上述氨基酸与其他物质作用而被化学修饰时，酶失去活性•（2）锌-羰基机理主要特征：底物的C-末端肽键的羰基通过锌的配位作用而极化，极化羰基的碳原子由于亲核反应发生水解作用。•第一步：Arg-145的胍基和底物的带负电荷的C-末端羧基相互吸引。•第二步：底物酪氨酸残基的芳基侧链进入酶的非极性口袋形空腔中挤走4H2O。•第三步:底物敏感肽键的-NH-基上的氮原子与酶的Tyr-248的-OH以氢键连结。•第四步：底物肽键上的羰基挤走了水分子而与锌配位，锌使羰基极化以致碳原子容易接受亲核进攻。•第五步：底物末端的羰基碳原子通过一个插入的水分子与酶的谷氨酸Glu-270的侧链以氢键连结。但最后这一步不一定发生。•羧肽酶与甘氨酰胺结合的过程，必须通过活性中心的重排，特别是酶分子的构象的重大改变才能实现。•Arg-145和Glu-270移动0.2nm，Arg的位移带动了肽链的扭转，使Tyr-248移动了1.2nm。•诱导喫合状态：酶分子构象改变，配位键、范德华力、静电吸引力和氢键等作用力，使酶分子与底物在空间和电荷上都很匹配，因而处于喫合状态。•羧肽酶与甘氨酰胺结合正是酶的诱导喫合状态的范例。•酶分子构象改变和各种相互作用力使底物肽键处于张力状体下，因此，反应活化能大大降低。•酶与底物结合后进一步反应的步骤有两种不同的观点。•第一种：Glu-270激活了水分子，提高了水分子的氧的亲核能力，向底物肽健羰基的碳原子进攻，Glu-270羰基质子化，Tyr-248也提供一个质子，肽键断裂，底物分解。第二种：•锌的作用：在锌-羰基机理中起了使肽键产生张力的作用，从而促进了底物的水解。由于Zn2+的作用，底物肽键的羰基碳原子的电子云密度降低而呈正电性，因此羰基碳原子更容易接受亲核进攻。•底物末端羧基与Arg-145带正电的胍基连结，触发了Tyr-248大幅度位移，酶显示活性。由此可见：酶与底物的诱导喫合是一个互相识别的动态过程。这个过程发生活性中心重排，使底物有可能被酶的功能基包围而发生催化。第三节：碳酸酐酶•广泛存在动物、植物和某些微生物体内。•可逆催化二氧化碳的水合作用，还能催化醛类水合作用和某些脂的水解。•碳酸酐酶分含Zn2+酶和不含Zn2+酶。•锌酶，红细胞中仅次于血红蛋白。一、组成、结构、功能•相对分子量约30000，单一肽链，每个分子含一个Zn2+，260个氨基酸残基，脯氨酸含量较高，没有二硫键。•通常碳酸酐酶指碳酸酐酶B。•椭球形，分子中有一个袋形空腔，Zn2+结合在空腔底部。Zn2+与His-93，95，117的N原字配位，第四配位可能有水分子或羟基占据•畸形四面体结构。•天然碳酸酐酶和脱锌的酶蛋白有相同的三级结构。因此，Zn2+在碳酸酐酶中不是起稳定空间结构的作用，而是活性中心组分。•Co2+取代锌，50%活性。大量实验表明，Co2+占据了Zn2+原来结合部位。•可推测：金属离子的配位环境是畸变四面体构型。•碳酸酐酶对于人和动物的呼吸作用极为重要。•在人与动物体内，由碳酸酐酶催化CO2和H2O合成HCO3-,当HCO3-随血液循环到肺泡后，又由碳酸酐酶催化使它解离为CO2排出体外。CO2+OH-⇋HCO3-•非酶催化速度远赶不上生理活动的需要。•碳酸酐酶催化的酶变率约为10-6s-1,即在37oC时1mol碳酸酐酶每秒中能催化106molCO2的可逆水合作用。